類固醇類化合物會引起人和某些動物的生殖障礙、畸形、機(jī)體發(fā)育異常和癌癥等疾病,它可能成為21世紀(jì)人類生殖健康所面臨的最大挑戰(zhàn)。而睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosteroni)是一種以類固醇類化合物為碳源的微生物。其3,17β-羥基類固醇脫氫酶(3,17β-HSD)是誘導(dǎo)降解類固醇類化合物的關(guān)鍵酶,位于3,17β-HSD下游的TetR編碼的蛋白可能作為3,17β-HSD的調(diào)控因子,抑制3,17β-HSD基因的表達(dá),降低對類固醇分解作用。本研究嘗試構(gòu)建TetR基因的突變菌株,分析TetR與3,17β-HSD的調(diào)控關(guān)系;同時構(gòu)建TetR基因表達(dá)載體,分析其活性蛋白與3,17β-HSD調(diào)控序列的結(jié)合位點(diǎn)。研究睪丸酮叢毛單胞菌TetR與3,17β-HSD表達(dá)調(diào)控關(guān)系對利用微生物降解的原理治理環(huán)境激素污染起到重要作用。實(shí)驗(yàn)主要分為兩大部分,第一部分是:構(gòu)建含有331 bp TetR突變基因的pK18-TetR載體,利用基因重組方法獲得TetR基因的突變菌株,通過分光光度法分析突變菌和野生菌的生長趨勢變化,并對睪丸酮誘導(dǎo)下野生菌與突變菌中3,17β-HSD表達(dá)及遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行分析,初...

【文章頁數(shù)】：58 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
英文縮寫符號
第一章 緒論
    1.1 睪丸酮叢毛單胞菌的研究進(jìn)展
        1.1.1 睪丸酮叢毛單胞菌
        1.1.2 睪丸酮叢毛單胞菌降解類固醇的關(guān)鍵酶
    1.2 基因敲除
    1.3 凝膠遷移實(shí)驗(yàn)
    1.4 金納米粒子光吸收特性及應(yīng)用
    1.5 研究內(nèi)容與展望
第二章 TETR基因敲除菌株的構(gòu)建及其3,17Β-HSD對睪丸酮的響應(yīng)特性
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 菌株及質(zhì)粒
        2.1.2 儀器與藥品
        2.1.3 主要試劑配制
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 TetR基因敲除的C.testosteroni突變菌株的構(gòu)建
        2.2.2 3 ,17β-HSD的表達(dá)和純化
        2.2.3 ELISA測定3,17β-HSD蛋白的表達(dá)
        2.2.4 睪丸酮對突變菌株3,17β-HSD蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)
        2.2.5 突變菌株遺傳穩(wěn)定性
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 重組質(zhì)粒和TetR基因敲除菌株的構(gòu)建
        2.3.2 3,17β-HSD的表達(dá)和純化
        2.3.3 3,17β-HSD蛋白表達(dá)量的標(biāo)準(zhǔn)曲線
        2.3.4 睪丸酮對突變菌株3,17β-HSD的誘導(dǎo)效應(yīng)
        2.3.5 突變菌株的遺傳穩(wěn)定性檢測
    2.4 小結(jié)
第三章 TETR蛋白對3,17Β-HSD表達(dá)調(diào)控位點(diǎn)的分析
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.1 質(zhì)粒和菌株
        3.1.2 儀器與藥品
        3.1.3 主要試劑配制
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 pET-15b-TetR基因表達(dá)載體的構(gòu)建
        3.2.2 TetR活性蛋白的提取
        3.2.3 EMSA和金納米粒子比色法測定TetR蛋白與DNA的相互作用
    3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.3.1 重組質(zhì)粒pET-15b-TetR的鑒定
        3.3.2 TetR活性蛋白的提取
        3.3.3 EMSA試驗(yàn)分析TetR蛋白與DNA的相互作用
        3.3.4 金納米粒子比色法測定TetR蛋白與DNA的相互作用
    3.4 小結(jié)
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝



本文編號：3742486