MtrA是放線菌中一個非常重要的保守調(diào)控因子。MtrA是結(jié)核分枝桿菌和谷氨酸棒狀桿菌細胞生存所必需的調(diào)控因子。結(jié)核分枝桿菌中MtrAMTB通過與oriC相互作用調(diào)節(jié)細胞增殖。而谷氨酸棒狀桿菌中MtrACGL的作用表現(xiàn)在維持細胞形態(tài)、抗生素的耐藥性和維持細胞滲透壓;它的靶基因具有多種功能,例如可以編碼推定的細胞壁肽酶、轉(zhuǎn)運蛋白和膜蛋白。本文對委內(nèi)瑞拉鏈霉菌中的MtrA功能進行初步研究,旨在探討該調(diào)控蛋白在委內(nèi)瑞拉鏈霉菌生命發(fā)育周期中起到的作用,以及對鏈霉菌氣生菌絲形成的調(diào)控作用。本實驗中先構(gòu)建含有目的基因上下游同源臂的敲除質(zhì)粒,進行屬間接合轉(zhuǎn)移實驗,篩選獲得調(diào)控基因mtrA/sven2756的缺失突變菌株△2756。將委內(nèi)瑞拉野生型菌株ISP5230與△2756進行表型分析以及生長曲線繪制,觀察到突變菌株△2756的生長速度明顯變慢,且無法分化產(chǎn)生氣生菌絲及孢子。為進一步確認突變菌株△2756的表型變化是由于缺失sven2756,本研究采用整合型載體pMS82,將含有sven2756啟動子區(qū)域的完整編碼序列連接到該載體上,通過接合轉(zhuǎn)移回補突變菌株△2756獲得回補菌株C-△2756。對菌... 

【文章頁數(shù)】：67 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 研究背景
    1.1 放線菌
        1.1.1 放線菌簡介
        1.1.2 分枝桿菌屬
        1.1.3 鏈霉菌屬
        1.1.4 棒狀桿菌屬
    1.2 放線菌保守調(diào)控因子MtrA
        1.2.1 細菌生命活動的調(diào)控
        1.2.2 結(jié)核分枝桿菌中MtrA的調(diào)控功能研究
        1.2.3 鏈霉菌中MtrA的調(diào)控功能研究
        1.2.4 谷氨酸棒狀桿菌中MtrA的調(diào)控功能研究
    1.3 立體依據(jù)與研究內(nèi)容
第二章 實驗材料和方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 菌株和質(zhì)粒
        2.1.2 引物
        2.1.3 培養(yǎng)基
        2.1.4 抗生素保存和使用濃度
    2.2 實驗方法
        2.2.1 鏈霉菌的菌種保藏及培養(yǎng)
        2.2.2 委內(nèi)瑞拉鏈霉菌基因組DNA的提取過程及所用試劑
        2.2.3 委內(nèi)瑞拉鏈霉菌突變株△2756和回補菌株C-△2756的構(gòu)建
            2.2.3.1 構(gòu)建突變質(zhì)粒pMu-SVEN2756
            2.2.3.2 屬間接合轉(zhuǎn)移獲得突變接合子
            2.2.3.3 篩選和驗證突變株△2756
            2.2.3.4 構(gòu)建、篩選和驗證回補菌株C-△2756
            2.2.3.5 獲得空載回補菌株V-△2756
        2.2.4 表型分析試驗
            2.2.4.1 委內(nèi)瑞拉鏈霉菌固體培養(yǎng)表型分析
            2.2.4.2 液體培養(yǎng)基中委內(nèi)瑞拉鏈霉菌的生長曲線測定
            2.2.4.3 掃描電子顯微鏡（SEM)觀察委內(nèi)瑞拉鏈霉菌孢子形態(tài)
        2.2.5 委內(nèi)瑞拉鏈霉菌總RNA的提取
        2.2.6 ISP5230與△2756的產(chǎn)孢相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平差異分析
        2.2.7 構(gòu)建、表達和純化His-SVEN2756融合蛋白
            2.2.7.1 構(gòu)建表達質(zhì)粒pET28a-2756
            2.2.7.2 誘導表達融合蛋白His-SVEN2756
            2.2.7.3 Ni柱法純化融合蛋白His-SVEN2756
        2.2.8 融合蛋白His-SVEN2756 SDS-PAGE電泳檢測以及濃度的測定
        2.2.9 調(diào)控因子與靶基因體外結(jié)合實驗——凝膠遷移試驗(EMSA)
第三章 實驗結(jié)果與分析
    3.1 SVEN2756的序列分析
    3.2 sven2756基因缺失突變菌株△2756的構(gòu)建
    3.3 回補菌株C-△2756的構(gòu)建
    3.4 pMS82空載體回補菌株V-△2756的構(gòu)建
    3.5 鏈霉菌表型分析
        3.5.1 ISP5230、△2756、C-△2756和V-△2756的表型觀察
        3.5.2 ISP5230、△2756和C-△2756菌株生長曲線的測定
        3.5.3 掃描電子顯微鏡觀察ISP5230、△2756和C-△2756的表型
    3.6 ISP5230與△2756菌株基因的轉(zhuǎn)錄水平分析
    3.7 獲得異源表達的SVEN2756蛋白
    3.8 SVEN2756與探針的體外結(jié)合試驗
第四章 總結(jié)與展望
    4.1 全文總結(jié)
    4.2 研究展望
參考文獻
致謝
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【參考文獻】：
期刊論文
[1]放線菌的研究現(xiàn)況與展望[J]. 張超群,戴建榮.  中國病原生物學雜志. 2019(01)
[2]影響凝膠遷移率實驗因素的教學改進[J]. 周超,趙翔宇,高新起,郭興啟,蘇英華.  實驗室科學. 2018(05)
[3]sco1135基因?qū)μ焖{色鏈霉菌M145孢子形成及次級代謝產(chǎn)物合成的調(diào)控研究[J]. 馬軍霞,張佩佩,王世立,曹廣祥.  生物技術(shù)通報. 2017(01)

博士論文
[1]天藍色鏈霉菌中一對新的雙組分信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)MacRS調(diào)控機制的研究[D]. 劉萌.山東大學 2019
[2]天藍色鏈霉菌cslA基因的研究[D]. 徐紅斌.華中農(nóng)業(yè)大學 2008

碩士論文
[1]天藍色鏈霉菌sco1135調(diào)控孢子生長和ACT次級代謝產(chǎn)物生物合成的分子機制研究[D]. 馬軍霞.濟南大學 2017
[2]天藍色鏈霉菌雙組分信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)SCO2120/SCO2121的功能研究[D]. 于曉秋.山東大學 2015



本文編號：3726934