DEAD-box家族蛋白是一類數(shù)量眾多、結(jié)構(gòu)高度保守的RNA解旋酶,參與多種生物學(xué)過(guò)程。近年來(lái),大量的研究發(fā)現(xiàn),DEAD-box RNA解旋酶還參與天然免疫調(diào)控,尤其在調(diào)控干擾素（Interferon,IFN）產(chǎn)生方面發(fā)揮重要作用,但不同的DEAD-box RNA解旋酶對(duì)IFN的產(chǎn)生及其下游信號(hào)通路的調(diào)控作用不同。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)豬源DDX18（p DDX18）和人源DDX18（h DDX18）與轉(zhuǎn)錄因子IRF3相互作用并抑制IRF3介導(dǎo)的IFN-β啟動(dòng)子激活,從而抑制IFN-β產(chǎn)生,從細(xì)胞水平證實(shí)DDX18具有調(diào)控干擾素的功能。為了從機(jī)體水平進(jìn)一步證實(shí)DDX18對(duì)干擾素的調(diào)控作用,本研究首次在鼠源細(xì)胞上驗(yàn)證了鼠源DDX18（mDDX18）負(fù)調(diào)控IFN-β產(chǎn)生,并在DDX18^+/-小鼠體內(nèi)評(píng)價(jià)了mDDX18敲低對(duì)病毒感染誘導(dǎo)IFN及IFN刺激基因（ISG）表達(dá)和對(duì)HSV-1及VSV增殖的影響。主要研究?jī)?nèi)容與結(jié)果如下:1. 干擾mDDX18促進(jìn)病毒誘導(dǎo)的IFN-β產(chǎn)生采用特異性si RNA干擾鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7內(nèi)源性DDX18的表達(dá),分析干擾mDDX18... 

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略語(yǔ)表(Abbreviation)
第1章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 DExD/H-box家族蛋白概述
    1.2 DEAD-box家族蛋白參與天然免疫調(diào)控
        1.2.1 DEAD-box家族蛋白正調(diào)控天然免疫
        1.2.2 DEAD-box家族蛋白負(fù)調(diào)控天然免疫
    1.3 DEAD-box家族蛋白影響病毒的增殖
        1.3.1 DDX1、DDX3與DDX5 影響病毒的增殖
        1.3.2 其它DEAD-box蛋白影響病毒的增殖
    1.4 基因敲除小鼠在DEAD-box家族蛋白研究中的應(yīng)用
        1.4.1 基于基因編輯技術(shù)的基因敲除小鼠模型構(gòu)建
        1.4.2 DEAD-box家族蛋白基因敲除小鼠的構(gòu)建與應(yīng)用
第2章 研究目的與意義
第3章 材料與方法
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.1 細(xì)胞、毒株、菌株與動(dòng)物
        3.1.2 載體與質(zhì)粒
        3.1.3 工具酶、試劑盒、血清和主要化學(xué)試劑
        3.1.4 Western blot實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.5 培養(yǎng)基和抗生素的配制
        3.1.6 主要緩沖液與相關(guān)試劑及其配制
        3.1.7 主要實(shí)驗(yàn)儀器及設(shè)備
        3.1.8 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)所需的材料和試劑
        3.1.9 分子生物學(xué)及序列分析軟件
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 細(xì)胞及動(dòng)物組織總RNA的提取
        3.2.2 cDNA的合成及目的片段擴(kuò)增
        3.2.3 限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)
        3.2.4 PCR產(chǎn)物或酶切產(chǎn)物的電泳檢測(cè)
        3.2.5 PCR產(chǎn)物或酶切產(chǎn)物的回收與純化
        3.2.6 外源DNA片段與質(zhì)粒載體的連接反應(yīng)
        3.2.7 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備(氯化鈣法)
        3.2.8 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
        3.2.9 重組質(zhì)粒的制備
        3.2.10 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染
        3.2.11 慢病毒的包裝與檢測(cè)
        3.2.12 Real-time PCR
        3.2.13 Western blot
        3.2.14 siRNA干擾實(shí)驗(yàn)
        3.2.15 基因敲除小鼠的生產(chǎn)、繁育和檢測(cè)
        3.2.16 HSV-1、VSV及 VSV-GFP病毒的增殖
        3.2.17 病毒滴度的測(cè)定
        3.2.18 小鼠攻毒實(shí)驗(yàn)與樣品處理
        3.2.19 MPM細(xì)胞的分離
        3.2.20 鼠源IFN-βELISA檢測(cè)
        3.2.21 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
第4章 結(jié)果與分析
    4.1 干擾mDDX18 促進(jìn)病毒誘導(dǎo)的IFN-β產(chǎn)生
        4.1.1 siRNA干擾效果檢測(cè)
        4.1.2 干擾mDDX18 促進(jìn)病毒誘導(dǎo)的IFN-β產(chǎn)生
    4.2 mDDX18 抑制IFN-β產(chǎn)生不依賴其ATP酶和解旋酶活性
        4.2.1 mDDX18 ATP酶和解旋酶活性突變位點(diǎn)的確定
        4.2.2 mDDX18及其酶活突變體質(zhì)粒的構(gòu)建
        4.2.3 mDDX18及其酶活突變體重組慢病毒的包裝與表達(dá)
        4.2.4 mDDX18 抑制IFN-β產(chǎn)生不依賴其ATP酶和解旋酶活性
    4.3 mDDX18基因敲除小鼠的鑒定與繁育
    4.4 敲低小鼠DDX18 促進(jìn)病毒誘導(dǎo)的IFN-β產(chǎn)生
        4.4.1 MPM細(xì)胞的分離與鑒定
        4.4.2 敲低小鼠DDX18 促進(jìn)病毒誘導(dǎo)的IFN-β產(chǎn)生
    4.5 敲低小鼠DDX18對(duì)HSV-1 誘導(dǎo)的天然免疫反應(yīng)和病毒增殖的影響
        4.5.1 敲低小鼠DDX18 促進(jìn)HSV-1 誘導(dǎo)的IFN-β產(chǎn)生
        4.5.2 敲低小鼠DDX18 抑制HSV-1 的增殖
    4.6 敲低小鼠DDX18對(duì)VSV誘導(dǎo)的天然免疫反應(yīng)和病毒增殖的影響
        4.6.1 敲低小鼠DDX18 促進(jìn)VSV誘導(dǎo)的IFN-β產(chǎn)生
        4.6.2 敲低小鼠DDX18 抑制VSV的增殖
第5章 討論與結(jié)論
    5.1 討論
        5.1.1 小鼠DDX18對(duì)IFN-β產(chǎn)生的影響
        5.1.2 小鼠DDX18對(duì)病毒增殖的影響
        5.1.3 DDX18調(diào)控天然免疫的機(jī)制探討
    5.2 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]Understanding the interaction of hepatitis C virus with host DEAD-box RNA helicases[J]. Megha Haridas Upadya,Jude Juventus Aweya,Yee-Joo Tan.  World Journal of Gastroenterology. 2014(11)

碩士論文
[1]DDX18負(fù)調(diào)控IFN-β產(chǎn)生的機(jī)制研究[D]. 王墨涵.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2019



本文編號(hào)：3721844