發(fā)布時間：2022-12-18 06:50

　　熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）具有較高的蛋白質、脂質水解力,和良好的嗜冷性,是生魚、肉類和乳制品中重要的革蘭氏陰性腐敗菌。群體感應是一種細胞間的交流機制,參與毒力因子分泌、生物被膜形成、食品腐敗等的調控�，F有研究表明希瓦氏菌、氣單胞菌、假單胞菌等革蘭氏陰性的致腐性與群體感應密切相關,然而,,P.fluuoescens中AHLs介導的QS系統(tǒng)分子信息及其調控生物被膜、腐敗和抗脅迫性的機制的研究較少。鑒于此,本研究以冷藏腐敗大黃魚中分離鑒定的優(yōu)勢腐敗菌P.fluorescensPF07為研究對象,采用生物報菌法和高效液相色譜串聯質譜（LC-MS/MS）檢測PF07中的AHLs活性,利用基因框架測序技術預測PF07全基因組,并對獲得的LuxI和LuxR蛋白進行生物信息學分析;構建并驗證luxl和luxR基因缺失株,比較研究野生株和缺失株的生長、生物被膜、致腐表型及抗脅迫性差異變化,評價luxI基因缺失株中外源添加C4-HSL的影響;基于轉錄組學測序技術研究luxI和luxR基因缺失對P.fluorescens的基因表達及代謝通路的影響,旨在更加全面地了解致腐菌... 

【文章頁數】：112 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 緒論
    1.1 生鮮食品中的腐敗菌
        1.1.1 食品腐敗菌類型
        1.1.2 熒光假單胞菌
    1.2 革蘭氏陰性菌與群體感應
        1.2.1 群體感應
        1.2.2 自誘導物、合成酶、受體及特異性
            1.2.2.1 自誘導物
            1.2.2.2 AHLs合成酶
            1.2.2.3 受體及特異性
        1.2.3 群體感應與食品腐敗
        1.2.4 群體感應與細菌生物被膜形成
        1.2.5 群體感應與細菌抗脅迫性
    1.3 假單胞菌中的群體感應
        1.3.1 銅綠假單胞菌中的群體感應
        1.3.2 熒光假單胞菌中的群體感應
        1.3.3 其他假單胞菌中的群體感應
    1.4 本課題的研究目的、意義和內容
第二章 熒光假單胞菌PF07基因組中LuxI/LuxR生物信息學分析
    2.1 前言
    2.2 材料與設備
        2.2.1 菌株及培養(yǎng)條件
        2.2.2 試劑
        2.2.3 主要儀器設備
    2.3 試驗方法
        2.3.1 報告菌法和LC/MS-MS檢測P.fluorescens PF07信號分子活性
            2.3.1.1 PF07生長曲線測定
            2.3.1.2 報告菌法檢測PF07信號分子活性
            2.3.1.3 PF07信號分子提取
            2.3.1.4 LC/MS-MS檢測PF07信號分子
        2.3.2 菌體的培養(yǎng)與收集
        2.3.3 總DNA的提取及全基因組測序
        2.3.4 文庫構建與質檢
        2.3.5 P.fluorescens PF07基因組組分分析
        2.3.6 P.fluorescens PF07基因功能注釋
        2.3.7 P.fluorescens PF07 Lux/LuxR基因PCR擴增
            2.3.7.1 DNA提取
            2.3.7.2 引物設計及PCR擴增
        2.3.8 LuxI/LuxR同源性、保守位點分析及三維結構模擬
    2.4 數據處理和分析
    2.5 結果分析
        2.5.1 報告菌法分析PF07信號分子活性
        2.5.2 LC/MS-MS檢測P.fluorescens PF07信號分子活性
        2.5.3 DNA文庫構建與測序質量評估
            2.5.3.1 測序數據概況
            2.5.3.2 基因組大小預測
            2.5.3.3 基因組組裝分析
        2.5.4 P.fluorescens PF07基因組組分分析
            2.5.4.1 編碼基因預測
            2.5.4.2 ncRNA預測
            2.5.4.3 Prophage預測
            2.5.4.4 CRISPRs預測
        2.5.5 P.fluorescens PF07基因功能分析
            2.5.5.1 P.fluorescens PF07蛋白質COG聚類分析
            2.5.5.2 P.fluorescens PF07次級代謝基因簇分析
        2.5.6 PCR驗證P.fluorescens PF07中LuxI與LuxR基因
        2.5.7 LuxI/LuxR進化樹、保守位點分析及三維結構模擬
    2.6 討論
第三章 LuxI/LuxR缺失對PF07生物被膜、致腐及抗脅迫力的影響
    3.1 前言
    3.2 材料與設備
        3.2.1 材料、菌株及培養(yǎng)條件
        3.2.2 試劑
        3.2.3 主要儀器設備
    3.3 實驗方法
        3.3.1 LuxI及LuxR缺失株的構建
        3.3.2 LuxI及LuxR缺失株基因缺失驗證
            3.3.2.1 DNA提取
            3.3.2.2 引物設計及PCR擴增
        3.3.3 報告菌法及LC-MS/MS檢測AHLs活性
        3.3.4 野生株和缺失株的生長能力比較
        3.3.5 野生株和缺失株的生物被膜形成能力測定
            3.3.5.1 結晶紫法測定生物被膜量
            3.3.5.2 粘附能力測定
            3.3.5.3 水溶性胞外多糖含量檢測
            3.3.5.4 CLSM及SEM觀察粘附被膜
            3.3.5.5 泳動能力測定
        3.3.6 野生株和缺失株在魚汁中腐敗能力測定
            3.3.6.1 滅菌魚汁制備和接種
            3.3.6.2 魚汁中生長曲線測定
            3.3.6.3 胞外蛋白酶活性測定
            3.3.6.4 嗜鐵素相對含量測定
            3.3.6.5 TVB-N含量測定
        3.3.7 野生株和缺失株抗脅迫力的測定
    3.4 數據處理和分析
    3.5 結果分析
        3.5.1 △luxR和△luxI基因缺失驗證
        3.5.2 生物報告菌法和LC-MS/MS檢測野生株和缺失株AHLs活性
        3.5.3 野生株和缺失株的生長
        3.5.4 野生株和缺失株生物被膜形成比較
            3.5.4.1 生物被膜結晶紫定量比較
            3.5.4.2 粘附能力
            3.5.4.3 水溶性胞外多糖含量比較
            3.5.4.4 CLSM及SEM觀察被膜結構差異
            3.5.4.5 泳動能力比較
        3.5.5 野生株和缺失株抗脅迫力比較
        3.5.6 野生株和缺失株在魚汁中腐敗能力比較
            3.5.6.1 魚汁中生長差異的比較
            3.5.6.2 胞外蛋白酶活性分析
            3.5.6.3 嗜鐵素相對含量比較
            3.5.6.4 TVB-N含量比較
    3.6 討論
第四章 基于轉錄組學分析LuxI/LuxR對PF07生理功能調控的機制
    4.1 前言
    4.2 材料與儀器
        4.2.1 主要試劑和培養(yǎng)基
        4.2.2 主要儀器
    4.3 轉錄組學測序
        4.3.1 細菌培養(yǎng)及樣品制備
        4.3.2 樣品總RNA提取純化及質量檢測
        4.3.3 文庫構建與測序
        4.3.4 質量控制與參考基因組比對分析
        4.3.5 基因表達水平分析及差異基因篩選
        4.3.6 差異基因篩選
        4.3.7 差異表達基因的GO富集
        4.3.8 差異表達基因的KEGG pathway富集
    4.4 熒光定量PCR驗證
        4.4.1 樣品總RNA提取
        4.4.2 總RNA反轉錄
        4.4.3 熒光定量PCR
    4.5 數據處理和分析
    4.6 結果與分析
        4.6.1 轉錄組reads質量與統(tǒng)計分析
        4.6.2 差異基因表達分析
        4.6.3 差異基因聚類分析
        4.6.4 差異表達基因GO富集分析
        4.6.5 差異表達基因GO富集分析KEGG Pathway富集分析結果
        4.6.6 差異表達基因分類整理
            4.6.6.1 LuxI/LuxR敲除對P.fluorscens生物被膜相關基因的影響
            4.6.6.2 LuxI/LuxR敲除對P.fluorscens致腐性相關基因的影響
            4.6.6.3 LuxI/LuxR敲除對P.fluorscens抗脅迫能力相關基因的影響
        4.6.9 熒光定量PCR驗證
            4.6.9.1 PCR產物擴增曲線及引物特異性分析
            4.6.9.2 基因表達量差異
        4.6.10 群體感應LuxI/LuxR調控機制模擬圖
    4.7 討論
第五章 總結、創(chuàng)新點和展望
    5.1 總結
    5.2 創(chuàng)新點
    5.3 展望
參考文獻
致謝
附錄Ⅰ 轉錄組學差異基因列表
附錄Ⅱ 攻讀碩士學位期間主要研究成果


【參考文獻】：
期刊論文
[1]大菱鲆熒光假單胞菌的群體感應現象及不同碳源培養(yǎng)下的腐敗特性研究[J]. 崔方超,李婷婷,劉明爽,馬燕,勵建榮.  現代食品科技. 2015(12)
[2]冷藏大黃魚SSO希瓦氏菌致腐能力差異機制初探[J]. 趙二科,朱軍莉,馮立芳,施永清,勵建榮.  水產學報. 2015(02)
[3]GB T5009—2003《食品衛(wèi)生檢驗方法》理化部分簡介[J]. 王竹天,蘭真,魯杰,蔣定國.  中國食品衛(wèi)生雜志. 2005(03)
[4]中華人民共和國專業(yè)標準出口干制腸衣檢驗方法[J].   商品與質量. 1996(03)

博士論文
[1]食源假單胞菌群體感應信號分子的產生及其對食品腐敗的影響[D]. 綦國紅.南京農業(yè)大學 2006
[2]3，5-DNBA降解菌和生物膜形成菌對硝基芳香烴廢水的生物強化處理研究[D]. 李蒙英.南京農業(yè)大學 2007

碩士論文
[1]大黃魚源Shewanella baltica群體感應LuxS蛋白及cyclo-（L-Pro-L-Leu）信號分子功能研究[D]. 葉曉鋒.浙江工商大學 2017



本文編號：3721571