豬流行性腹瀉病毒（Procine epidemic diaherra virus,PEDV）是豬病毒性腹瀉爆發(fā)的主要病原之一,在感染仔豬后,會引起豬的流行性腹瀉（Procine epidemic diaherra,PED）。哺乳期仔豬發(fā)病率及病死率極高。自2010年,PED在我國大面積爆發(fā),因此對PEDV的流行情況進行持續(xù)的監(jiān)測十分必要。本研究首先將PEDV N基因連接到p EASY-Blunt Simple載體,構(gòu)建標準質(zhì)粒。利用該質(zhì)粒上的T7啟動子,體外轉(zhuǎn)錄RNA模板作為熒光定量RT-PCR的標準品。對靈敏度的驗證表明,本研究所建立的實時熒光定量PCR方法最低可以檢測到10個拷貝。通過檢測多種病毒,評估該方法的特異性及準確度,結(jié)果表明,僅PEDV可以擴增到曲線,而其他病原均無曲線擴增;無論是批內(nèi)重復試驗還是批間重復試驗,其CT值的變異系數(shù)均在2%以下,表明該方法特異性強,準確度高。用建立好的RT-PCR方法對2018-2019年山東省四個地區(qū)采集的161份臨床樣品進行檢測,陽性率在25.71-41.93%。這表明PEDV在本研究所取樣地區(qū)豬群中的流行較為嚴重,對該病的防控工作刻不容... 

【文章頁數(shù)】：61 頁

【學位級別】：碩士

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符號說明
中文摘要
Abstract
1 前言
    1.1 PEDV的病原學特點
        1.1.1 PEDV的形態(tài)及理化特征
        1.1.2 PEDV的分類
    1.2 PEDV的分子生物學
        1.2.1 PEDV的復制酶基因及其蛋白
        1.2.2 PEDV的 ORF3 基因及其蛋白
        1.2.3 PEDV的S基因及其蛋白
        1.2.4 PEDV的M基因及其蛋白
        1.2.5 PEDV的N基因及其蛋白
        1.2.6 PEDV的E基因及其蛋白
    1.3 PEDV的流行病學
    1.4 PEDV的臨床癥狀和病理變化
        1.4.1 臨床癥狀
        1.4.2 病理變化
    1.5 PEDV的防控
        1.5.1 PEDV傳統(tǒng)疫苗
        1.5.2 PEDV基因工程疫苗
    1.6 PEDV的診斷技術
    1.7 本研究的目的意義
2 材料和方法
    2.1 材料
        2.1.1 病料來源
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 主要儀器
        2.1.4 主要配制試劑
    2.2 方法
        2.2.1 PEDV熒光定量RT-PCR檢測方法的建立
            2.2.1.1 引物和探針的設計
            2.2.1.2 樣品處理
            2.2.1.3 病毒RNA的提取
            2.2.1.4 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應
            2.2.1.5 擴增產(chǎn)物的回收
            2.2.1.6 回收產(chǎn)物的連接
            2.2.1.7 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
            2.2.1.8 質(zhì)粒的提取
            2.2.1.9 PEDV-N基因標準質(zhì)粒的制備
            2.2.1.10 熒光定量RT-PCR標準品的制備
            2.2.1.11 熒光定量RT-PCR的建立和條件優(yōu)化
            2.2.1.12 熒光定量RT-PCR標準曲線的建立
            2.2.1.13 熒光定量RT-PCR的敏感性檢測
            2.2.1.14 熒光定量RT-PCR的特異性檢測
            2.2.1.15 熒光定量RT-PCR的重復性檢測
            2.2.1.16 臨床樣品的檢測
        2.2.2 六株PEDV流行株S基因的遺傳進化分析
            2.2.2.1 引物設計
            2.2.2.2 樣品模板的制備
            2.2.3.3 PEDV S基因的RT-PCR擴增
            2.2.3.4 PEDVS基因的遺傳進化分析
        2.2.3 SDLY01株的分離與鑒定
            2.2.3.1 PEDV流行株的分離
            2.2.3.2 間接免疫熒光(IFA)
        2.2.4 PEDV SDLY1801 株全基因組序列測定及拼接
            2.2.4.1 SDLY1801序列的分段擴增與測序
            2.2.4.2 PEDV SDLY1801 毒株遺傳進化分析
3 結(jié)果與分析
    3.1 基于N基因的PEDV熒光定量PCR檢測方法的建立
        3.1.1 熒光定量PCR標準品的構(gòu)建
        3.1.2 實時熒光定量RT-PCR的建立和條件優(yōu)化
        3.1.3 標準曲線的建立
        3.1.4 實時熒光定量PCR的敏感性檢測
        3.1.5 實時熒光定量PCR的特異性檢測
        3.1.6 實時熒光定量PCR的重復性檢測
        3.1.7 臨床樣品PEDV檢測結(jié)果
    3.2 六株PEDV流行株S基因的分段擴增及分析
        3.2.1 PEDV毒株S基因的RT-PCR分段擴增
        3.2.2 PEDV毒株S基因的核苷酸和氨基酸同源性分析
        3.2.3 PEDV毒株S基因的變異情況分析
        3.2.4 PEDV毒株S基因的遺傳進化分析
    3.3 PEDV SDLY1801 的分離與鑒定與遺傳進化分析
        3.3.1 PEDV SDLY1801 的分離與鑒定
        3.3.2 PEDV SDLY1801 毒株的IFA鑒定
        3.3.3 PEDV SDLY1801 的全基因擴增結(jié)果
        3.3.4 PEDV SDLY1801 株基因組結(jié)構(gòu)分析
        3.3.5 PEDV SDLY1801 株基因組同源性與遺傳進化分析
        3.3.6 PEDV SDLY1801株S基因同源性與遺傳進化分析
        3.3.7 PEDV SDLY1801株M基因同源性與遺傳進化分析
        3.3.8 PEDV SDLY1801株N基因同源性與遺傳進化分析
        3.3.9 PEDV SDLY1801株E基因同源性與遺傳進化分析
4 討論
    4.1 PEDV特異性熒光定量RT-PCR方法的建立
    4.2 山東部分地區(qū)PEDV流行株S基因的序列分析
    4.3 山東部分地區(qū)PEDV SDLY1801 株的分離鑒定與病毒基因序列分析
5 結(jié)論
參考文獻
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
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碩士論文
[1]豬流行性腹瀉病毒（PEDV）S蛋白高變區(qū)（1-496aa）線性B細胞表位肽的鑒定[D]. 劉英杰.齊魯工業(yè)大學 2019
[2]豬四種腹瀉病毒快速鑒別檢測方法及豬流行性腹瀉病毒分子流行病學研究[D]. 王睿敏.廣西大學 2019
[3]豬流行性腹瀉病毒重組沙門氏菌的構(gòu)建及免疫原性分析[D]. 徐麗麗.華中農(nóng)業(yè)大學 2011
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本文編號：3703652