發(fā)布時(shí)間：2022-11-06 14:19

　　豬流行性腹瀉病毒（Procine epidemic diaherra virus,PEDV）是豬病毒性腹瀉爆發(fā)的主要病原之一,在感染仔豬后,會(huì)引起豬的流行性腹瀉（Procine epidemic diaherra,PED）。哺乳期仔豬發(fā)病率及病死率極高。自2010年,PED在我國大面積爆發(fā),因此對PEDV的流行情況進(jìn)行持續(xù)的監(jiān)測十分必要。本研究首先將PEDV N基因連接到p EASY-Blunt Simple載體,構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒。利用該質(zhì)粒上的T7啟動(dòng)子,體外轉(zhuǎn)錄RNA模板作為熒光定量RT-PCR的標(biāo)準(zhǔn)品。對靈敏度的驗(yàn)證表明,本研究所建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法最低可以檢測到10個(gè)拷貝。通過檢測多種病毒,評(píng)估該方法的特異性及準(zhǔn)確度,結(jié)果表明,僅PEDV可以擴(kuò)增到曲線,而其他病原均無曲線擴(kuò)增;無論是批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)還是批間重復(fù)試驗(yàn),其CT值的變異系數(shù)均在2%以下,表明該方法特異性強(qiáng),準(zhǔn)確度高。用建立好的RT-PCR方法對2018-2019年山東省四個(gè)地區(qū)采集的161份臨床樣品進(jìn)行檢測,陽性率在25.71-41.93%。這表明PEDV在本研究所取樣地區(qū)豬群中的流行較為嚴(yán)重,對該病的防控工作刻不容... 

【文章頁數(shù)】：61 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
符號(hào)說明
中文摘要
Abstract
1 前言
    1.1 PEDV的病原學(xué)特點(diǎn)
        1.1.1 PEDV的形態(tài)及理化特征
        1.1.2 PEDV的分類
    1.2 PEDV的分子生物學(xué)
        1.2.1 PEDV的復(fù)制酶基因及其蛋白
        1.2.2 PEDV的 ORF3 基因及其蛋白
        1.2.3 PEDV的S基因及其蛋白
        1.2.4 PEDV的M基因及其蛋白
        1.2.5 PEDV的N基因及其蛋白
        1.2.6 PEDV的E基因及其蛋白
    1.3 PEDV的流行病學(xué)
    1.4 PEDV的臨床癥狀和病理變化
        1.4.1 臨床癥狀
        1.4.2 病理變化
    1.5 PEDV的防控
        1.5.1 PEDV傳統(tǒng)疫苗
        1.5.2 PEDV基因工程疫苗
    1.6 PEDV的診斷技術(shù)
    1.7 本研究的目的意義
2 材料和方法
    2.1 材料
        2.1.1 病料來源
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 主要儀器
        2.1.4 主要配制試劑
    2.2 方法
        2.2.1 PEDV熒光定量RT-PCR檢測方法的建立
            2.2.1.1 引物和探針的設(shè)計(jì)
            2.2.1.2 樣品處理
            2.2.1.3 病毒RNA的提取
            2.2.1.4 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)
            2.2.1.5 擴(kuò)增產(chǎn)物的回收
            2.2.1.6 回收產(chǎn)物的連接
            2.2.1.7 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
            2.2.1.8 質(zhì)粒的提取
            2.2.1.9 PEDV-N基因標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的制備
            2.2.1.10 熒光定量RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)品的制備
            2.2.1.11 熒光定量RT-PCR的建立和條件優(yōu)化
            2.2.1.12 熒光定量RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
            2.2.1.13 熒光定量RT-PCR的敏感性檢測
            2.2.1.14 熒光定量RT-PCR的特異性檢測
            2.2.1.15 熒光定量RT-PCR的重復(fù)性檢測
            2.2.1.16 臨床樣品的檢測
        2.2.2 六株P(guān)EDV流行株S基因的遺傳進(jìn)化分析
            2.2.2.1 引物設(shè)計(jì)
            2.2.2.2 樣品模板的制備
            2.2.3.3 PEDV S基因的RT-PCR擴(kuò)增
            2.2.3.4 PEDVS基因的遺傳進(jìn)化分析
        2.2.3 SDLY01株的分離與鑒定
            2.2.3.1 PEDV流行株的分離
            2.2.3.2 間接免疫熒光(IFA)
        2.2.4 PEDV SDLY1801 株全基因組序列測定及拼接
            2.2.4.1 SDLY1801序列的分段擴(kuò)增與測序
            2.2.4.2 PEDV SDLY1801 毒株遺傳進(jìn)化分析
3 結(jié)果與分析
    3.1 基于N基因的PEDV熒光定量PCR檢測方法的建立
        3.1.1 熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建
        3.1.2 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR的建立和條件優(yōu)化
        3.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
        3.1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的敏感性檢測
        3.1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的特異性檢測
        3.1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的重復(fù)性檢測
        3.1.7 臨床樣品PEDV檢測結(jié)果
    3.2 六株P(guān)EDV流行株S基因的分段擴(kuò)增及分析
        3.2.1 PEDV毒株S基因的RT-PCR分段擴(kuò)增
        3.2.2 PEDV毒株S基因的核苷酸和氨基酸同源性分析
        3.2.3 PEDV毒株S基因的變異情況分析
        3.2.4 PEDV毒株S基因的遺傳進(jìn)化分析
    3.3 PEDV SDLY1801 的分離與鑒定與遺傳進(jìn)化分析
        3.3.1 PEDV SDLY1801 的分離與鑒定
        3.3.2 PEDV SDLY1801 毒株的IFA鑒定
        3.3.3 PEDV SDLY1801 的全基因擴(kuò)增結(jié)果
        3.3.4 PEDV SDLY1801 株基因組結(jié)構(gòu)分析
        3.3.5 PEDV SDLY1801 株基因組同源性與遺傳進(jìn)化分析
        3.3.6 PEDV SDLY1801株S基因同源性與遺傳進(jìn)化分析
        3.3.7 PEDV SDLY1801株M基因同源性與遺傳進(jìn)化分析
        3.3.8 PEDV SDLY1801株N基因同源性與遺傳進(jìn)化分析
        3.3.9 PEDV SDLY1801株E基因同源性與遺傳進(jìn)化分析
4 討論
    4.1 PEDV特異性熒光定量RT-PCR方法的建立
    4.2 山東部分地區(qū)PEDV流行株S基因的序列分析
    4.3 山東部分地區(qū)PEDV SDLY1801 株的分離鑒定與病毒基因序列分析
5 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]豬流行性腹瀉病毒黏液SIgA抗體ELISA檢測方法的建立[J]. 王永恒,周孟云,李昱辰,劉朋,楊倩.  中國獸醫(yī)科學(xué). 2020(01)
[2]基于豬流行性腹瀉病毒N蛋白間接ELISA抗體檢測方法的建立及初步應(yīng)用[J]. 楊朋霞,閆若潛,王華俊,馬震原,王淑娟,趙雪麗,謝彩華,趙月龍,李孟.  中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2019(10)
[3]豬流行性腹瀉病毒JX16株的分離鑒定及體外傳代對其毒力的影響[J]. 唐融志,陳智,焦安琪,趙魯,于江,張玉玉,孫文博,張樹金,曾昊,彭軍,吳家強(qiáng).  中國畜牧獸醫(yī). 2019(06)
[4]PEDV雙抗體夾心ELISA檢測方法的建立[J]. 馬宇聰,劉增素,王書博,周晗,姜艷萍,崔文,王麗,喬薪瑗,唐麗杰,徐義剛,李一經(jīng).  中國獸醫(yī)科學(xué). 2019(09)
[5]2013～2018年廣西部分規(guī)模豬場主要病毒性腹瀉疫病流行病學(xué)調(diào)查研究[J]. 何穎,秦毅斌,段群棚,張藝杰,盧冰霞,胡庭俊,李曉玉,周英寧,周展宏,劉磊,梁家幸,李斌,蔣冬福,盧敬專,蘇乾蓮,劉棋,趙武.  中國動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào). 2019(03)
[6]豬流行性腹瀉病毒變異毒株與傳統(tǒng)毒株RT-PCR鑒別診斷方法的建立[J]. 趙攀登,趙勝杰,王巖,鄧同煒,盧建洲,劉靜靜,朱文龍,冀夢瑤,陳益.  中國動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào). 2019(06)
[7]基于DPO引物檢測豬流行性腹瀉病毒熒光定量RT-PCR方法的建立及初步應(yīng)用[J]. 王以欣,王紫薇,漢武嬌,王麗,姜艷平,崔文,周晗,喬薪瑗,唐麗杰,李一經(jīng),徐義剛.  中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2019(07)
[8]PEDV分離株S1基因的重組桿狀病毒真核表達(dá)[J]. 何海健,吳瑗,王魯彥,李群景,巴少波,石林,邵春艷,孫靜,姜?jiǎng)?王曉杜.  中國畜牧獸醫(yī). 2019(03)
[9]豬流行性腹瀉傳染性胃腸炎雙重RT-PCR檢測方法的建立及優(yōu)化[J]. 趙光偉,涂少宇,汪洋,賀然,賴靖堯,譚陽春,郭道兵,牛晨霞,楊曉偉.  中國獸醫(yī)雜志. 2018(10)
[10]基于PEDV M基因RT-LAMP快速檢測方法的建立與應(yīng)用[J]. 陳希文,尹苗,汪謙,楊勤,楊鳳,李蓮,羅文濤,周杰瓏,馬纓,趙洪.  中國獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2018(09)

碩士論文
[1]豬流行性腹瀉病毒（PEDV）S蛋白高變區(qū)（1-496aa）線性B細(xì)胞表位肽的鑒定[D]. 劉英杰.齊魯工業(yè)大學(xué) 2019
[2]豬四種腹瀉病毒快速鑒別檢測方法及豬流行性腹瀉病毒分子流行病學(xué)研究[D]. 王睿敏.廣西大學(xué) 2019
[3]豬流行性腹瀉病毒重組沙門氏菌的構(gòu)建及免疫原性分析[D]. 徐麗麗.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2011
[4]豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉二聯(lián)核酸疫苗免疫效力研究[D]. 孟凡丹.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 2011



本文編號(hào)：3703652