發(fā)布時間：2022-10-08 19:17

　　近年來,基于CRISPR/Cas9的堿基編輯技術因其具有不產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂、無需外源DNA模板、不依賴宿主同源重組修復的優(yōu)勢,已經(jīng)逐漸發(fā)展成為一種強大的基因組編輯工具,在動物、植物、酵母和細菌中得到了開發(fā)和應用。研究團隊前期已在重要的工業(yè)模式菌株谷氨酸棒桿菌中開發(fā)了一種多元自動化的堿基編輯技術MACBETH,為進一步優(yōu)化該方法,提高堿基編輯技術在谷氨酸棒桿菌中的應用效率,本研究首先在谷氨酸棒桿菌中構建了基于綠色熒光蛋白（GFP）的檢測系統(tǒng):將GFP基因的起始密碼子ATG人工突變?yōu)锳CG,GFP無法正常表達,當該密碼子的C經(jīng)編輯后恢復為T,即實現(xiàn)GFP蛋白的復活,結(jié)合流式細胞儀分析技術,可快速衡量編輯效率。然后,構建針對靶標位點的堿基編輯工具,經(jīng)測試,該位點可成功被編輯,在初始編輯條件下堿基編輯效率為（13.11±0.21）%。在此基礎上,通過對不同培養(yǎng)基類型、誘導初始OD600、誘導時間、誘導物濃度進行優(yōu)化,確定最優(yōu)編輯條件是:培養(yǎng)基為CGXII,初始OD600為0.05,誘導時間為20 h,IPTG濃度為0.01 mmol/L。經(jīng)過優(yōu)化,編輯效率達到（30.35±0.75）%,較初... 

【文章頁數(shù)】：9 頁

【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 材料
        1.1.1 菌種和質(zhì)粒
        1.1.2 酶、引物及相關試劑盒
        1.1.3 培養(yǎng)基
    1.2 方法
        1.2.1 谷氨酸棒桿菌GFP基因的整合
        1.2.2 靶標GFP基因的堿基編輯工具的構建
        1.2.3 谷氨酸棒桿菌的轉(zhuǎn)化
        1.2.4 谷氨酸棒桿菌的培養(yǎng)及堿基編輯
            1)種子培養(yǎng)
            2)誘導培養(yǎng)
        1.2.5 流式細胞儀分析GFP蛋白復活比例
        1.2.6 堿基編輯條件的優(yōu)化
2 結(jié)果與分析
    2.1 谷氨酸棒桿菌GFP熒光檢測系統(tǒng)的構建
    2.2 堿基編輯工具復活GFP熒光蛋白
    2.3 堿基編輯條件優(yōu)化
        2.3.1 培養(yǎng)基類型的優(yōu)化
        2.3.2 誘導時初始OD600的優(yōu)化
        2.3.3 誘導時間的優(yōu)化
        2.3.4 誘導劑濃度的優(yōu)化
    2.4 最優(yōu)堿基編輯條件的進一步驗證
3 討論


【參考文獻】：
期刊論文
[1]堿基編輯器的開發(fā)及其在細菌基因組編輯中的應用[J]. 趙亞偉,姜衛(wèi)紅,鄧子新,汪志軍,蘆銀華.  微生物學通報. 2019(02)



本文編號：3688275