尿素酰胺水解酶（Urea amidolyase,UA）屬于生物素依賴的羧化酶家族,能夠?qū)⒛蛩剞D(zhuǎn)化為氨,在自然界氮循環(huán)中具有重要作用。尿素酰胺水解酶是一種廣泛分布于細(xì)菌,真菌,藻類和植物中的雙功能酶。在UA進(jìn)行尿素轉(zhuǎn)化時,需要其C端生物素羧化酶（BC）、羧基轉(zhuǎn)移酶（CT）及N端脲基甲酸鹽水解酶（AH）結(jié)構(gòu)域間的緊密協(xié)同,以實(shí)現(xiàn)底物/產(chǎn)物的順序傳遞和與相應(yīng)酶活的聯(lián)動,從而依次完成生物素羧化、羧基轉(zhuǎn)移至尿素、脲基甲酸鹽水解等步驟。有意思的是,雖然同家族的其他成員均通過寡聚體的形式來完成對底物的羧化,但UA的酶活不依賴于寡聚。UC與AH結(jié)構(gòu)域各自的晶體結(jié)構(gòu)已知,但前者僅捕捉到擬羧基轉(zhuǎn)移狀態(tài)的構(gòu)象,由于結(jié)晶不成功,酶的全長結(jié)構(gòu)仍未解決,因而其整體構(gòu)架及工作過程中介導(dǎo)結(jié)構(gòu)域間通訊的長程構(gòu)象變化還不清楚。在前期工作中,我們已經(jīng)獲得了高度均一的乳酸酵母UA（kluyveromyces lactis,KIUA）全酶。本論文首次通過單顆粒透射電鏡技術(shù)報(bào)道了KIUA可溶性同源二聚體形式的整體結(jié)構(gòu)及構(gòu)象變化形式。無論KIUA是否與配體和底物一起孵育,所解析的結(jié)構(gòu)都代表了一種中間狀態(tài),即生物素-羧基載體蛋白（B... 

【文章頁數(shù)】：61 頁

【學(xué)位級別】：碩士

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中文摘要
Abstract
第一章 引言
    1.1 氮元素在自然界中的循環(huán)
    1.2 生物素依賴性羧化酶家族
        1.2.1 乙酰輔酶A羧化酶
        1.2.2 丙酮酸羧化酶
        1.2.3 丙酰輔酶A羧化酶
    1.3 尿素酰胺水解酶簡介
        1.3.1 尿素羧化酶結(jié)構(gòu)和功能
        1.3.2 脲基甲酸鹽水解酶結(jié)構(gòu)和功能
    1.4 KIUA發(fā)揮酶活變構(gòu)機(jī)制的獨(dú)特性分析
    1.5 與KIUA相關(guān)的現(xiàn)有生物素依賴性羧化酶晶體結(jié)構(gòu)分析
    1.6 KIUA的變構(gòu)機(jī)制假說
    1.7 小結(jié)
第二章 不同狀態(tài)下尿素酰胺水解酶的電鏡觀察
    2.1 實(shí)驗(yàn)方法
        2.1.1 負(fù)染色技術(shù)概述
        2.1.2 負(fù)染色技術(shù)原理
        2.1.3 透射電鏡簡介
        2.1.4 透射電鏡使用前操作及調(diào)試
        2.1.5 負(fù)染制樣前準(zhǔn)備
        2.1.6 負(fù)染制樣方法
    2.2 對KlUA、KlUA+ADP和 KlUA+ADP+Urea的負(fù)染觀察
    2.3 小結(jié)
第三章 不同狀態(tài)下尿素酰胺水解酶的三維結(jié)構(gòu)
    3.1 實(shí)驗(yàn)方法
        3.1.1 電鏡三維重構(gòu)技術(shù)
    3.2 數(shù)據(jù)的收集與處理流程
    3.3 三維重構(gòu)結(jié)果
    3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
        3.4.1 KIUA+ADP+urea的三維結(jié)構(gòu)分析
        3.4.2 KIUA+ADP的三維結(jié)構(gòu)分析
        3.4.3 KIUA的三維結(jié)構(gòu)分析
    3.5 討論與展望
參考文獻(xiàn)
致謝



本文編號：3657010