細(xì)胞分裂素（Cytokinins,CKs）是一類(lèi)調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育的重要激素,與葉片衰老、植物抗病及非生物脅迫等均有密切的聯(lián)系。近年來(lái),CK合成代謝及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究已經(jīng)比較清楚,但是CK轉(zhuǎn)運(yùn)的分子機(jī)制研究尚不夠深入。生化活性鑒定是激素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白研究的難點(diǎn)。AtABCG14是首個(gè)被發(fā)現(xiàn)的長(zhǎng)距離運(yùn)輸CK的半分子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,在根部tZ（trans-zeatin,tZ）類(lèi)CK向地上組織運(yùn)輸過(guò)程中發(fā)揮重要功能,但AtABCG14生化活性有待深入研究。因此,為了更加簡(jiǎn)易有效地研究CK轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的生化活性,以及更加深入的研究AtABCG14的轉(zhuǎn)運(yùn)活性,我們建立了一種可操作性強(qiáng)且有效的植物激素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性檢測(cè)方法,并利用該方法檢測(cè)了AtABCG14轉(zhuǎn)運(yùn)活性。具體研究結(jié)果如下:（1）建立了一種簡(jiǎn)易有效地研究植物激素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的方法。建立了煙草瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)和液相二級(jí)質(zhì)譜（Liquid Chromatography-Mass/Mass Spectrometry,LC-MS/MS）激素檢測(cè)方法（煙草-質(zhì)譜法）,我們利用該方法檢測(cè)了已報(bào)道的ABA外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AtABCG25、JA外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AtABCG16、細(xì)胞分裂... 

【文章來(lái)源】：浙江師范大學(xué)浙江省

【文章頁(yè)數(shù)】：78 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

在煙草中AtABCG25介導(dǎo)ABA的外排轉(zhuǎn)運(yùn)

第三章結(jié)果與分析44圖3.2在煙草中AtABCG16介導(dǎo)JA的外排轉(zhuǎn)運(yùn)（A）35s::GFP（pMDC43）和35s::GFP-AtABCG16在煙草葉片中的亞細(xì)胞定位；Bar=50μm。（B）外排實(shí)驗(yàn)前煙草中JA的含量。（C）在0、20、40、60、90min時(shí)，對(duì)AtABCG16和空載體煙草葉片中外排緩沖液中的JA和（D）ABA（陰性對(duì)照）測(cè)定。（E）在有無(wú)1mM的釩酸鈉處理的情況下，60min時(shí)煙草葉片中外排樣品的JA的比值（GFP-AtABCG16和空載）。數(shù)據(jù)表示為平均值±SD（n=4），顯著性差異（t檢驗(yàn)）用*表示：*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001。Figure3.2AtABCG16mediatedeffluxtransportofJAintobacco.(A)Subcellularlocalizationof35s::GFP(pMDC43)and35s::GFP-AtABCG16intobaccoleaves.Bar=50μm.(B)JAcontentintobaccobeforeefflux.(C)QuantificationofeffluxtransportedJAand(D)ABA(negativecontrol)fromtobaccoleavestransformedwithGFP-AtABCG16oremptyvectoratthetimepointsof0,20,40,60,90min.(E)TheratiosofeffluxtransportedJAfromtobaccoleaves(withGFP-AtABCG16andemptyvectorexpression)inthepresenceorabsenceof1mMsodiumvanadatefor60min.Dataaremeans±SE(n=4).*,**and***indicateP-valuesofP<0.05,P<0.01andP<0.001respectively,fromStudent’st-test.1.3煙草-質(zhì)譜體系檢測(cè)AtPUP14活性通過(guò)煙草-質(zhì)譜體系建立的對(duì)激素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性檢測(cè)的方法，通過(guò)對(duì)AtABCG25和AtABCG16轉(zhuǎn)運(yùn)活性實(shí)驗(yàn)初步證明了該方法的可行性。該方法是否可以用于激素內(nèi)運(yùn)蛋白的活性檢測(cè)，為了證實(shí)這一點(diǎn)，我們選取了AtPUP14進(jìn)行驗(yàn)證，AtPUP14已報(bào)到定位于細(xì)胞膜上，且通過(guò)同位素追蹤實(shí)驗(yàn)證明其對(duì)tZ有向胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)幕钚訹59]。

第三章結(jié)果與分析45同AtABCG25和AtABCG16步驟一致，首先在煙葉中瞬時(shí)表達(dá)GFP-AtPUP14后，通過(guò)GFP的亞細(xì)胞定位觀察（圖3.3A）以及和WesternBlot結(jié)果（圖3.3B），可以確認(rèn)該蛋白定位于煙草表皮細(xì)胞的細(xì)胞膜且表達(dá)正確。在轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)前對(duì)空載體（freeGFP）和GFP-AtPUP14中細(xì)胞分裂素含量檢測(cè)（圖3.3C），葉片中含量較多的tZR和含量較多的tZ均無(wú)差異后，進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)活性實(shí)驗(yàn)（圖3.2D-H），在0-90min內(nèi)，尤其是在60-90min內(nèi)，GFP-AtPUP14比空載體（freeGFP）緩沖液中的tZ含量有所下降，而tZR、iP、iPR和cZR其他細(xì)胞分裂素?zé)o顯著性變化。以上結(jié)果表明，用該方法可以證明AtPUP14有向胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)tZ的生化活性。圖3.3在煙草中AtPUP14介導(dǎo)CK的胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)（A）35s::GFP（pMDC43）和35s::GFP-AtPUP14在煙草葉片中的亞細(xì)胞定位；Bar=50μm。（B）Westernblotting檢測(cè)GFP-AtPUP14的電泳圖，以35s::GFP為空白對(duì)照。（C）外排實(shí)驗(yàn)前煙草中tZ和tZR的含量。（D-H）在0、10、20、40、60、90min時(shí)，對(duì)AtPUP14和空載體的緩沖液中tZ、tZR、iP、iPR和cZR的測(cè)定。數(shù)據(jù)表示為平均值±SD（n=4），顯著性差異（t檢驗(yàn)）用*表示：*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001。Figure3.3AtPUP14mediatedinfluxtransportofCKintobacco.(A)Subcellularlocalizationof35s::GFP(pMDC43)and35s::GFP-AtPUP14intobaccoleaves.Bar=50μm.(B)TheelectrophoregramofwesternblottingtodetectGFP-AtPUP14.35s::GFP(pMDC43)expressionwasusedasacontrol.(C)tZandtZRcontentintobaccobeforeefflux.(D-H)QuantificationofinfluxtransportedtZ,tZR,iP,iPRandcZRfromtobaccoleavestransformedwithAtPUP14oremptyvectoratthetimepointsof0,10,20,40,60,90min.Dataaremeans±SE(n=4).*,**and***indicate


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