糖苷水解酶GH97家族是一個(gè)特殊的家族,同時(shí)擁有反轉(zhuǎn)和保留兩種催化類型成員,其兩種催化類型如何分化目前還不清楚。對(duì)GH97家族成員PspAG97A的催化機(jī)制進(jìn)行分析,通過高效液相色譜法檢測(cè)水解產(chǎn)物異頭物的構(gòu)型,根據(jù)在不同酶反應(yīng)時(shí)間所檢測(cè)到的α-葡萄糖與β-葡萄糖的比例變化,證明PspAG97A執(zhí)行反轉(zhuǎn)催化機(jī)制。通過結(jié)構(gòu)分析與定點(diǎn)突變等方法嘗試對(duì)PspAG97A的催化類型進(jìn)行改造,將PspAG97A與同一家族成員BtGH97b(保留型)活性中心進(jìn)行疊加比較,仿照保留類型的催化裝置對(duì)相關(guān)位點(diǎn)G407、E377及E456進(jìn)行單點(diǎn)突變和聯(lián)合突變。結(jié)果顯示突變酶活力相比野生型顯著下降,并分析了相關(guān)位點(diǎn)的作用。研究加深了對(duì)PspAG97A催化機(jī)制的認(rèn)識(shí),為GH97家族兩種催化類型進(jìn)化關(guān)系的研究奠定基礎(chǔ)。

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圖1PspAG97A結(jié)構(gòu)示意圖

使用Pymol軟件對(duì)PspAG97A與GH97家族中執(zhí)行保留類型催化機(jī)制的α-半乳糖苷水解酶BtGH97b進(jìn)行結(jié)構(gòu)比對(duì)分析,仿照保留類型的催化裝置,將PspAG97A催化中心的Gly407突變?yōu)閷?duì)應(yīng)于BtGH97b中的Asp415,使其作為親核體。而Glu480作為廣義酸堿,先后....

圖2重組酶與突變酶的SDS-PAGE檢測(cè)分析

α-葡萄糖苷酶PspAG97A以外切的方式水解底物非還原末端,斷開α-1,4-糖苷鍵釋放出一分子葡萄糖。通過HPLC方法檢測(cè)了PspAG97A降解pNPαG降解產(chǎn)物的異頭碳形式。如圖3所示,在反應(yīng)初始階段,酶催化底物pNPαG水解產(chǎn)生β-D-葡萄糖。隨著酶反應(yīng)時(shí)間的增加,α型:....

圖3PspAG97A水解產(chǎn)物異頭碳構(gòu)型分析

圖2重組酶與突變酶的SDS-PAGE檢測(cè)分析2.4PspAG97A與突變酶的酶活力分析

圖4PspAG97A與催化類型轉(zhuǎn)變相關(guān)突變體的酶活力大小

以pNPαG作為底物,重組酶PspAG97A作為對(duì)照,測(cè)定突變酶水解底物的活力大小,并運(yùn)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS17.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較分析。從圖4可以看出,突變酶的比活力與重組酶相比降低了100倍以上,差異顯著(P<0.05)。而突變酶之間相比,差異不顯著(P>0.05)。這說明....

本文編號(hào)：4001839