發(fā)布時(shí)間：2021-10-30 09:26

　　海藻糖是一種非還原性二糖;是通過1,1糖苷鍵連接兩個(gè)吡喃型葡萄糖單體所構(gòu)成的;化學(xué)名稱為α-D-吡喃葡糖基-α-D-吡喃葡糖苷（α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside）,被稱為生命之糖。海藻糖的化學(xué)性質(zhì)很穩(wěn)定,在生物體內(nèi)具有抗脫水功能,因此生物在干旱、寒冷、高鹽堿等脅迫條件下,海藻糖能夠保護(hù)生物膜以及蛋白質(zhì)等減少傷害,對生物體具有非常好的非特異性保護(hù)作用。由于海藻糖的制備工藝比較復(fù)雜,生產(chǎn)成本高,因此海藻糖的市場應(yīng)用受到一定的阻礙。本實(shí)驗(yàn)以蠟狀芽孢桿菌Bacillus cereus的β-淀粉酶和海藻糖合酶為出發(fā)點(diǎn),通過替換海藻糖合酶生產(chǎn)菌以及改變?nèi)诤厦傅倪B接方式,構(gòu)建了β-淀粉酶-海藻糖合酶融合酶,并對融合酶的一些酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行初步的探索。本研究內(nèi)容主要包括以下幾方面:（1）β-淀粉酶與不同來源的海藻糖合酶雙功能融合酶的構(gòu)建與表達(dá):通過PCR分別克隆了來源于菌種Pseudomonas stutzeri、Thermobaculum terrenum、Pseudomonas putide P06的海藻糖合酶基因,并且通過連接肽（EAAAK）3構(gòu)建了β-淀... 

【文章來源】：齊魯工業(yè)大學(xué)山東省

【文章頁數(shù)】：82 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第1章 緒論
    1.1 海藻糖的簡介
        1.1.1 海藻糖的結(jié)構(gòu)
        1.1.2 海藻糖的特性
        1.1.3 海藻糖的合成方式
        1.1.4 海藻糖的應(yīng)用
    1.2 海藻糖合酶的研究進(jìn)展
        1.2.1 海藻糖合酶的簡介
        1.2.2 海藻糖合酶的作用機(jī)理
        1.2.3 海藻糖合酶基因工程研究進(jìn)展
    1.3 融合酶的研究進(jìn)展
        1.3.1 融合酶的簡介
        1.3.2 融合酶的連接方法
    1.4 蛋白異源表達(dá)與純化技術(shù)
        1.4.1 蛋白異源表達(dá)與純化的簡介
        1.4.2 蛋白異源表達(dá)體系分類
        1.4.3 蛋白純化流程簡介
        1.4.4 蛋白純化技術(shù)的現(xiàn)狀
    1.5 圓二色光譜的研究進(jìn)展與應(yīng)用
        1.5.1 圓二色光譜技術(shù)的簡介
        1.5.2 圓二色光譜技術(shù)在測定蛋白方面的應(yīng)用
    1.6 立題的背景和研究意義
第2章 β-淀粉酶與不同來源的海藻糖合酶融合酶的構(gòu)建與表達(dá)
    2.1 引言
    2.2 實(shí)驗(yàn)材料
        2.2.1 菌種和質(zhì)粒
        2.2.2 主要儀器與設(shè)備
        2.2.3 分子生物學(xué)試劑與酶
        2.2.4 主要試劑
        2.2.5 相關(guān)溶液與培養(yǎng)基的配置
    2.3 實(shí)驗(yàn)方法
        2.3.1 重組質(zhì)粒pET-28a-ba的構(gòu)建
            2.3.1.1 質(zhì)粒pET-28a的提取
            2.3.1.2 蠟樣芽孢桿菌基因組DNA的提取
            2.3.1.3 表達(dá)引物的設(shè)計(jì)
            2.3.1.4 大腸桿菌E.coli DH5α感受態(tài)的制備
            2.3.1.5 β-淀粉酶基因的克隆與轉(zhuǎn)化
        2.3.2 β-淀粉酶與不同來源的海藻糖合酶融合酶的構(gòu)建
            2.3.2.1 引物的設(shè)計(jì)
            2.3.2.2 不同來源海藻糖合酶基因(ts)的擴(kuò)增
            2.3.2.3 重組質(zhì)粒pET-28a-ba的提取
            2.3.2.4 不同來源海藻糖合酶基因與質(zhì)粒pET-28a-ba的連接與轉(zhuǎn)化
            2.3.2.5 陽性重組子的驗(yàn)證
        2.3.3 融合酶的誘導(dǎo)表達(dá)與純化以及融合蛋白濃度的測定(以重組菌株 E.coli BL21(pET-28a-bap3ts Ps)為例)
            2.3.3.1 融合酶的誘導(dǎo)表達(dá)及酶活驗(yàn)證
            2.3.3.2 融合酶Ni-NTA親和層析純化及蛋白濃度的測定
        2.3.4 重組菌株酶活性質(zhì)的測定
            2.3.4.1 融合酶最適溫度的測定
            2.3.4.2 融合酶最適pH的測定
            2.3.4.3 不同金屬離子對融合酶的影響
            2.3.4.4 融合酶動力學(xué)參數(shù)的測定(BL21(pET-28a-bap3ts Ps)以及BL21(pET-28a-bap3 ts Tt))
    2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論
        2.4.1 融合酶重組質(zhì)粒的構(gòu)建過程
        2.4.2 空載pET-28a質(zhì)粒的提取
        2.4.3 β-淀粉酶基因(ba)的克隆
        2.4.4 重組質(zhì)粒pET-28a-ba陽性重組子的驗(yàn)證
        2.4.5 PCR擴(kuò)增不同來源的海藻糖合酶基因
        2.4.6 重組融合酶的構(gòu)建(以重組質(zhì)粒pET-28a-bap3ts Ps為例)
        2.4.7 融合酶的表達(dá)與催化
        2.4.8 融合酶酶活特性的測定
    2.5 本章小結(jié)
第3章 利用抗蛋白酶降解連接肽的融合酶的構(gòu)建與表達(dá)
    3.1 引言
    3.2 實(shí)驗(yàn)材料
        3.2.1 工程菌及質(zhì)粒
        3.2.2 主要儀器
        3.2.3 分子生物學(xué)試劑與酶
        3.2.4 主要試劑
        3.2.5 培養(yǎng)基與相關(guān)溶液的配置
    3.3 實(shí)驗(yàn)方法
        3.3.1 抗蛋白酶降解的連接肽以及引物的設(shè)計(jì)
        3.3.2 質(zhì)粒pET-28a-bap3ts Ps和 pUC57-shishi-17 的提取
        3.3.3 抗蛋白酶降解連接肽替換片段的連接
            3.3.3.1 連接肽替換片段(SS17)的擴(kuò)增
            3.3.3.2 質(zhì)粒pUC57-shishi-17與pET-28a-bap3ts Ps 的雙酶切
            3.3.3.3 目的片段與質(zhì)粒pET-28a-bap3ts Ps的連接
        3.3.4 陽性重組子的檢測與驗(yàn)證
        3.3.5 融合酶的誘導(dǎo)表達(dá)及酶活驗(yàn)證
        3.3.6 重組融合酶BL21(pET-28a-bap4ts Ps)酶活特性的測定
            3.3.6.1 重組融合酶最適溫度的測定
            3.3.6.2 重組融合酶最適pH的測定
            3.3.6.3 不同金屬離子對重組融合酶酶活的影響
            3.3.6.4 圓二色光譜檢測蛋白二級空間的變化(重組融合酶BL21(pET-28a-bap4tsPs)與原始融合酶BL21(pET-28a-bap3tsPs)以及單酶比較)
    3.4 結(jié)果與討論
        3.4.1 融合酶重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        3.4.2 連接肽替換片段(SS17)的擴(kuò)增
        3.4.3 質(zhì)粒pUC57-shishi-17與pET-28a-bap3ts Ps的雙酶切
        3.4.4 重組質(zhì)粒pET-28a-bap4ts Ps陽性重組子的驗(yàn)證
        3.4.5 重組融合酶的誘導(dǎo)表達(dá)與酶活驗(yàn)證
        3.4.6 重組融合酶酶活特性的檢測
    3.5 本章小結(jié)
第4章 利用插入融合的方式構(gòu)建融合酶
    4.1 引言
    4.2 實(shí)驗(yàn)材料
        4.2.1 工程菌及質(zhì)粒
        4.2.2 主要儀器
        4.2.3 分子生物學(xué)試劑與酶
        4.2.4 主要試劑
        4.2.5 培養(yǎng)基與相關(guān)溶液配置
    4.3 實(shí)驗(yàn)方法
        4.3.1 插入位點(diǎn)以及插入融合主體與客體的選擇
        4.3.2 表達(dá)引物的設(shè)計(jì)
        4.3.3 海藻糖合酶基因的擴(kuò)增
        4.3.4 重組質(zhì)粒pET-28a-ba的線性化
        4.3.5 重組質(zhì)粒pET-28a-bats Ps的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化
        4.3.6 陽性重組子的檢測與驗(yàn)證
        4.3.7 重組菌株E. coli BL21(pET-28a-bats Ps)的異源表達(dá)與酶活驗(yàn)證
    4.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4.4.1 PCR 擴(kuò)增海藻糖合酶基因(tsPs)
        4.4.2 載體pET-28a-ba的線性化
        4.4.3 陽性重組子的鑒定
        4.4.4 重組融合酶BL21(pET-28a-bats Ps)的蛋白表達(dá)與酶活驗(yàn)證
    4.5 本章小結(jié)
第5章 結(jié)論與展望
    5.1 結(jié)論
    5.2 展望
參考文獻(xiàn)
致謝
在校期間主要研究成果


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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