海藻糖是一種非還原性二糖;是通過1,1糖苷鍵連接兩個吡喃型葡萄糖單體所構成的;化學名稱為α-D-吡喃葡糖基-α-D-吡喃葡糖苷（α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside）,被稱為生命之糖。海藻糖的化學性質很穩(wěn)定,在生物體內具有抗脫水功能,因此生物在干旱、寒冷、高鹽堿等脅迫條件下,海藻糖能夠保護生物膜以及蛋白質等減少傷害,對生物體具有非常好的非特異性保護作用。由于海藻糖的制備工藝比較復雜,生產成本高,因此海藻糖的市場應用受到一定的阻礙。本實驗以蠟狀芽孢桿菌Bacillus cereus的β-淀粉酶和海藻糖合酶為出發(fā)點,通過替換海藻糖合酶生產菌以及改變融合酶的連接方式,構建了β-淀粉酶-海藻糖合酶融合酶,并對融合酶的一些酶學性質進行初步的探索。本研究內容主要包括以下幾方面:（1）β-淀粉酶與不同來源的海藻糖合酶雙功能融合酶的構建與表達:通過PCR分別克隆了來源于菌種Pseudomonas stutzeri、Thermobaculum terrenum、Pseudomonas putide P06的海藻糖合酶基因,并且通過連接肽（EAAAK）3構建了β-淀... 

【文章來源】：齊魯工業(yè)大學山東省

【文章頁數(shù)】：82 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第1章 緒論
    1.1 海藻糖的簡介
        1.1.1 海藻糖的結構
        1.1.2 海藻糖的特性
        1.1.3 海藻糖的合成方式
        1.1.4 海藻糖的應用
    1.2 海藻糖合酶的研究進展
        1.2.1 海藻糖合酶的簡介
        1.2.2 海藻糖合酶的作用機理
        1.2.3 海藻糖合酶基因工程研究進展
    1.3 融合酶的研究進展
        1.3.1 融合酶的簡介
        1.3.2 融合酶的連接方法
    1.4 蛋白異源表達與純化技術
        1.4.1 蛋白異源表達與純化的簡介
        1.4.2 蛋白異源表達體系分類
        1.4.3 蛋白純化流程簡介
        1.4.4 蛋白純化技術的現(xiàn)狀
    1.5 圓二色光譜的研究進展與應用
        1.5.1 圓二色光譜技術的簡介
        1.5.2 圓二色光譜技術在測定蛋白方面的應用
    1.6 立題的背景和研究意義
第2章 β-淀粉酶與不同來源的海藻糖合酶融合酶的構建與表達
    2.1 引言
    2.2 實驗材料
        2.2.1 菌種和質粒
        2.2.2 主要儀器與設備
        2.2.3 分子生物學試劑與酶
        2.2.4 主要試劑
        2.2.5 相關溶液與培養(yǎng)基的配置
    2.3 實驗方法
        2.3.1 重組質粒pET-28a-ba的構建
            2.3.1.1 質粒pET-28a的提取
            2.3.1.2 蠟樣芽孢桿菌基因組DNA的提取
            2.3.1.3 表達引物的設計
            2.3.1.4 大腸桿菌E.coli DH5α感受態(tài)的制備
            2.3.1.5 β-淀粉酶基因的克隆與轉化
        2.3.2 β-淀粉酶與不同來源的海藻糖合酶融合酶的構建
            2.3.2.1 引物的設計
            2.3.2.2 不同來源海藻糖合酶基因(ts)的擴增
            2.3.2.3 重組質粒pET-28a-ba的提取
            2.3.2.4 不同來源海藻糖合酶基因與質粒pET-28a-ba的連接與轉化
            2.3.2.5 陽性重組子的驗證
        2.3.3 融合酶的誘導表達與純化以及融合蛋白濃度的測定(以重組菌株 E.coli BL21(pET-28a-bap3ts Ps)為例)
            2.3.3.1 融合酶的誘導表達及酶活驗證
            2.3.3.2 融合酶Ni-NTA親和層析純化及蛋白濃度的測定
        2.3.4 重組菌株酶活性質的測定
            2.3.4.1 融合酶最適溫度的測定
            2.3.4.2 融合酶最適pH的測定
            2.3.4.3 不同金屬離子對融合酶的影響
            2.3.4.4 融合酶動力學參數(shù)的測定(BL21(pET-28a-bap3ts Ps)以及BL21(pET-28a-bap3 ts Tt))
    2.4 實驗結果與討論
        2.4.1 融合酶重組質粒的構建過程
        2.4.2 空載pET-28a質粒的提取
        2.4.3 β-淀粉酶基因(ba)的克隆
        2.4.4 重組質粒pET-28a-ba陽性重組子的驗證
        2.4.5 PCR擴增不同來源的海藻糖合酶基因
        2.4.6 重組融合酶的構建(以重組質粒pET-28a-bap3ts Ps為例)
        2.4.7 融合酶的表達與催化
        2.4.8 融合酶酶活特性的測定
    2.5 本章小結
第3章 利用抗蛋白酶降解連接肽的融合酶的構建與表達
    3.1 引言
    3.2 實驗材料
        3.2.1 工程菌及質粒
        3.2.2 主要儀器
        3.2.3 分子生物學試劑與酶
        3.2.4 主要試劑
        3.2.5 培養(yǎng)基與相關溶液的配置
    3.3 實驗方法
        3.3.1 抗蛋白酶降解的連接肽以及引物的設計
        3.3.2 質粒pET-28a-bap3ts Ps和 pUC57-shishi-17 的提取
        3.3.3 抗蛋白酶降解連接肽替換片段的連接
            3.3.3.1 連接肽替換片段(SS17)的擴增
            3.3.3.2 質粒pUC57-shishi-17與pET-28a-bap3ts Ps 的雙酶切
            3.3.3.3 目的片段與質粒pET-28a-bap3ts Ps的連接
        3.3.4 陽性重組子的檢測與驗證
        3.3.5 融合酶的誘導表達及酶活驗證
        3.3.6 重組融合酶BL21(pET-28a-bap4ts Ps)酶活特性的測定
            3.3.6.1 重組融合酶最適溫度的測定
            3.3.6.2 重組融合酶最適pH的測定
            3.3.6.3 不同金屬離子對重組融合酶酶活的影響
            3.3.6.4 圓二色光譜檢測蛋白二級空間的變化(重組融合酶BL21(pET-28a-bap4tsPs)與原始融合酶BL21(pET-28a-bap3tsPs)以及單酶比較)
    3.4 結果與討論
        3.4.1 融合酶重組質粒的構建
        3.4.2 連接肽替換片段(SS17)的擴增
        3.4.3 質粒pUC57-shishi-17與pET-28a-bap3ts Ps的雙酶切
        3.4.4 重組質粒pET-28a-bap4ts Ps陽性重組子的驗證
        3.4.5 重組融合酶的誘導表達與酶活驗證
        3.4.6 重組融合酶酶活特性的檢測
    3.5 本章小結
第4章 利用插入融合的方式構建融合酶
    4.1 引言
    4.2 實驗材料
        4.2.1 工程菌及質粒
        4.2.2 主要儀器
        4.2.3 分子生物學試劑與酶
        4.2.4 主要試劑
        4.2.5 培養(yǎng)基與相關溶液配置
    4.3 實驗方法
        4.3.1 插入位點以及插入融合主體與客體的選擇
        4.3.2 表達引物的設計
        4.3.3 海藻糖合酶基因的擴增
        4.3.4 重組質粒pET-28a-ba的線性化
        4.3.5 重組質粒pET-28a-bats Ps的構建與轉化
        4.3.6 陽性重組子的檢測與驗證
        4.3.7 重組菌株E. coli BL21(pET-28a-bats Ps)的異源表達與酶活驗證
    4.4 實驗結果
        4.4.1 PCR 擴增海藻糖合酶基因(tsPs)
        4.4.2 載體pET-28a-ba的線性化
        4.4.3 陽性重組子的鑒定
        4.4.4 重組融合酶BL21(pET-28a-bats Ps)的蛋白表達與酶活驗證
    4.5 本章小結
第5章 結論與展望
    5.1 結論
    5.2 展望
參考文獻
致謝
在校期間主要研究成果


【參考文獻】：
期刊論文
[1]犬干擾素α2與犬白蛋白融合基因在昆蟲細胞中的表達與活性分析[J]. 王晶宇,歐陽偉,錢晶,王曉麗,夏興霞,諸玉梅,畢振威,王永山.  畜牧獸醫(yī)學報. 2019(10)
[2]聚乙二醇沉淀聯(lián)用雙水相萃取法純化蛋清溶菌酶的研究[J]. 聞崇煒,趙燁清,石莉,歐陽臻.  生物技術通報. 2017(05)
[3]蔗糖濃度對滲透休克法提取細胞周質重組蛋白的影響[J]. 郭建華.  安徽農業(yè)科學. 2017(04)
[4]大腸桿菌產海藻糖合成酶發(fā)酵條件優(yōu)化[J]. 楊梅玉,趙偉,陳文娜,張曰輝,曹大鵬.  中國釀造. 2015(10)
[5]哺乳動物細胞表達外源基因常用病毒載體的研究進展[J]. 謝寶明,魏圓圓,喬自林,于國偉,李向茸,馮玉萍,令世鑫,馬忠仁,柏家林.  西北民族大學學報(自然科學版). 2015(01)
[6]海藻糖在日化領域的應用研究進展[J]. 劉宗利,王乃強,劉峰,李克文,柏帥.  精細與專用化學品. 2015(02)
[7]海藻糖的特性、功能及應用[J]. 靳文斌,李克文,胥九兵,張友亮,肖兆玲,張倩,劉開昌,龔魁杰.  精細與專用化學品. 2015(01)
[8]海藻糖生物合成及應用研究進展[J]. 曲茂華,張鳳英,何名芳,陳衛(wèi)平.  食品工業(yè)科技. 2014(16)
[9]反復凍融法破碎基因工程受體細胞的研究[J]. 李亞君,姚萍,王春俠,宋莉.  生物技術世界. 2013(04)
[10]融合酶的設計和應用研究進展[J]. 黃子亮,張翀,吳希,蘇楠,邢新會.  生物工程學報. 2012(04)



本文編號：3466484