目的構(gòu)建大鼠RNAi-腺苷A2a受體（A2aR）慢病毒載體并進(jìn)行鑒定。方法首先構(gòu)建3對(duì)短發(fā)夾RNA（shRNA）-A2aR序列（shRNA-A2aR 1、shRNA-A2aR 2、shRNA-A2aR 3）,在shRNA慢病毒載體中分別插入3對(duì)雙鏈shRNA oligo,shRNA慢病毒重組質(zhì)粒構(gòu)建成功后,將重組質(zhì)粒、包裝載體、穿梭載體共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,從而獲得病毒液。實(shí)驗(yàn)Ⅰ采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠原代心肌細(xì)胞分為3組（n=6）:空載組（V組）、shRNA-A2aR 1組和shRNA-A2aR 3組,各組分別轉(zhuǎn)染MOI為10的相應(yīng)病毒液,轉(zhuǎn)染48 h時(shí),Western blot法檢測(cè)A2aR表達(dá)水平,確定干擾效率,以篩選最佳慢病毒載體。實(shí)驗(yàn)Ⅱ采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠原代心肌細(xì)胞分為5組（n=36）:空載組（V組）、MOI5組、MOI10組、MOI15組和MOI20組,各組分別轉(zhuǎn)染相應(yīng)MOI的病毒液（最佳慢病毒載體）,于轉(zhuǎn)染24、48和72 h時(shí),采用CCK-8法測(cè)定細(xì)胞存活率,熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞活力和細(xì)胞死亡情況,Western blot法檢測(cè)A2aR表達(dá)水平,確定干擾效率。結(jié)果實(shí)驗(yàn)Ⅰ... 

【文章來源】：中華麻醉學(xué)雜志. 2020,40(07)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：5 頁


本文編號(hào)：3433386