作為一種重要的模式工業(yè)微生物和食品安全微生物,枯草芽孢桿菌在工業(yè)酶和功能營養(yǎng)品的生產(chǎn)方面具有廣泛應(yīng)用。近年來,隨著對枯草芽孢桿菌遺傳調(diào)控機制的不斷揭示,多種研究策略和技術(shù),包括基因編輯系統(tǒng)、基因回路、空間支架、無細胞表達系統(tǒng)等,被用于設(shè)計和構(gòu)建枯草芽孢桿菌底盤細胞高效合成各種生物化學(xué)品。本文首先對基于基因編輯和基于內(nèi)源性調(diào)控系統(tǒng)的枯草芽孢桿菌底盤細胞設(shè)計與構(gòu)建的策略進行了系統(tǒng)的概述。然后,以高產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖、七烯甲萘醌、核黃素、透明質(zhì)酸和β-環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶為例介紹了枯草芽孢桿菌底盤細胞工廠的應(yīng)用。最后,從基因編輯效率提升、基因回路響應(yīng)信號拓展和基因組設(shè)計與重構(gòu)三方面對枯草芽孢桿菌底盤細胞的設(shè)計、構(gòu)建與應(yīng)用進行了展望。 

【文章來源】：合成生物學(xué). 2020,1(02)

【文章頁數(shù)】：19 頁

【部分圖文】：

CRISPRa/CRISPRi系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄激活和抑制的示意圖

無細胞蛋白表達系統(tǒng)（cell-free protein synthesis,CFPS），是一種相對胞內(nèi)表達系統(tǒng)而言的開放表達系統(tǒng)。它是以外源m RNA或DNA為模板，利用原核或真核細胞抽提物的酶系，添加氨基酸、RNA聚合酶和能量物質(zhì)等來表達蛋白質(zhì)的體外翻譯系統(tǒng)[69]（圖2）。利用無細胞蛋白表達系統(tǒng)，可以提高蛋白合成的效率，還可以通過摻入非天然氨基酸，在體外表達非天然蛋白質(zhì)[70]。盡管無細胞系統(tǒng)通過制備方法的優(yōu)化得到了一些改進[71]，但這些研究大部分集中在E.coli無細胞系統(tǒng)的改進上，而針對B.subtilis無細胞系統(tǒng)的報道較少。作為一種重要的GRAS模式生物，B.subtilis無細胞系統(tǒng)的開發(fā)可能更適用于廣泛的微生物學(xué)、合成生物學(xué)和工業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用。比如，B.subtilis調(diào)控元件的無細胞系統(tǒng)在與體內(nèi)研究結(jié)合時可發(fā)揮協(xié)同優(yōu)勢，經(jīng)過多輪無細胞表征的工作流程可導(dǎo)致設(shè)計周期的快速迭代，從而有助于在體內(nèi)進行最終的設(shè)計[72]。由于B.subtilis 168表達的異源蛋白質(zhì)容易被其自身分泌的內(nèi)源性蛋白酶降解，因此利用B.subtilis 168無細胞系統(tǒng)表達異源蛋白的能力有限，只能產(chǎn)生低產(chǎn)量的報告蛋白GFP（小于0.3μg/m L）。因此，研究人員選擇蛋白酶缺陷菌株B.subtilis WB800N作為出發(fā)菌株[73]，通過工程化啟動子文庫表征的遺傳調(diào)控元件來優(yōu)化B.subtilis WB800N無細胞系統(tǒng)，對58種不同類型啟動子構(gòu)建的無細胞GFPmut3b體系進行初步篩選，在體外利用B.subtilis WB800N細胞提取物一起表達GFPmut3b，通過GFPmut3b的表征確定了幾種不同強度啟動子的B.subtilis WB800N無細胞體系[15]。改良的B.subtilis WB800N無細胞系統(tǒng)能夠進行持續(xù)數(shù)小時的無細胞轉(zhuǎn)錄翻譯反應(yīng)，并產(chǎn)生多達0.8μmol/L GFPmut3b，是B.subtilis 168無細胞轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)（0.011μmol/L GFPmut3b）的72倍。最后將B.subtilis WB800N無細胞系統(tǒng)應(yīng)用在誘導(dǎo)型表達系統(tǒng)中，以腎素?zé)晒馑孛笧閳蟾娴鞍�，證明了B.subtilis WB800N無細胞轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)對異源蛋白的生產(chǎn)和表征具有潛在的適用性。除啟動子的轉(zhuǎn)錄強弱外，影響B(tài).subtilis WB800N無細胞系統(tǒng)表達異源蛋白的效率可能還包括其他因素，例如，在無細胞系統(tǒng)表達蛋白質(zhì)過程中，產(chǎn)生的乳酸、乙酸或無機磷酸鹽會導(dǎo)致體系的p H值發(fā)生變化，這也可能對無細胞體系有害。而這些限制因素可以通過使用其他能源得以緩解，比如，麥芽糖是一種能在E.coli無細胞表達系統(tǒng)中消耗抑制性無機磷酸鹽的碳源物質(zhì)[74]。通過這些潛在抑制因素的研究可以進一步提高B.subtilis無細胞表達系統(tǒng)的效率，從而快速、大量生產(chǎn)具有高營養(yǎng)價值的功能性蛋白。

在B.subtilis中，感受態(tài)的形成受到兩種感受態(tài)因子（Com X和CFS）的調(diào)節(jié)，當(dāng)細胞達到一定的數(shù)目，感受態(tài)因子的濃度積累到一定臨界值時誘導(dǎo)感受態(tài)的形成[80]。由com Q編碼的Com Q蛋白經(jīng)修飾處理后，產(chǎn)生具有活性的信號分子Com X并分泌到胞外，使信號感應(yīng)蛋白Com P發(fā)生自磷酸化，隨后該酶將相應(yīng)的應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白Com A磷酸化，磷酸化的Com A和srf操縱子結(jié)合，激活該操縱子的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生Com S蛋白，Com S與Clp C、Com K、Mec A蛋白一起參與接下來的信號傳導(dǎo)，細胞進入感受態(tài)狀態(tài)。CSF發(fā)揮作用的方式與Com Q有一些不同，由phr編碼的CSF前體在跨膜轉(zhuǎn)運后形成成熟的CSF，當(dāng)胞外的CSF濃度達到一定濃度時，通過Spo0K轉(zhuǎn)運至胞內(nèi)，通過抑制Rap C的活性從而促進Com A的磷酸化，促進感受態(tài)的形成[81]�；谏鲜鲈�，Guan等[21]利用參與信號傳導(dǎo)的srf操縱子的啟動子Psrf A，構(gòu)建了一種不需要添加誘導(dǎo)劑的細胞密度依賴型B.subtilis表達系統(tǒng)，可以實現(xiàn)菌體的高密度生長及異源蛋白氨肽酶和納豆激酶的高效表達。而芽孢的形成主要受到組氨酸激酶Kin A-E和轉(zhuǎn)錄因子Spo0A的調(diào)節(jié)：Spo0A受到群體響應(yīng)信號分子Phr-Rap的調(diào)節(jié)，經(jīng)過組氨酸激酶Kin A-E和兩個磷酸轉(zhuǎn)移蛋白Spo0F和Spo0B的作用，Spo0A被磷酸化，調(diào)控相關(guān)靶基因的表達，進而促進芽孢的形成。Rap60不僅可抑制Spo0A磷酸化水平，也可以抑制Kin A的活性，而Rap60則可以被響應(yīng)細胞密度的信號分子Phr60所抑制[82]�；谠撛恚珻ui等[22]在B.subtilis中開發(fā)了一種Phr60-Rap60-Spo0A雙功能群體響應(yīng)調(diào)控系統(tǒng)，細胞濃度增加可同時激活和抑制多個基因模塊系統(tǒng)的表達，并將該系統(tǒng)動態(tài)控制B.subtilis 168中七烯甲萘醌的合成途徑，驗證了該系統(tǒng)的有效性。2.3 Ⅰ型毒素/抗毒素調(diào)控系統(tǒng)

【參考文獻】：
期刊論文
[1]枯草芽孢桿菌ccpA基因敲除及對其核黃素產(chǎn)量的影響[J]. 應(yīng)明,班睿.  微生物學(xué)報. 2006(01)

博士論文
[1]基因組簡化枯草芽孢桿菌的構(gòu)建及應(yīng)用[D]. 李楊.天津大學(xué) 2017



本文編號：3342966