同型融合和蛋白質(zhì)分選復(fù)合體（HOPS）由VPS11、VPS16、VPS18、VPS33、VPS39和VPS41這6種蛋白組成,能夠通過膜融合機(jī)制來調(diào)節(jié)生物體內(nèi)的膜泡運(yùn)輸。已有研究表明其可以作為融合因子來促進(jìn)自噬體與溶酶體膜融合過程。為在體外確定HOPS復(fù)合體與自噬性SNARE蛋白STX17是否具有直接相互作用,首先利用PCR技術(shù)從已有質(zhì)粒中擴(kuò)增得到6種基因的編碼序列,將其連接至pGEX 4T-1-GST或pET-His-NusA原核表達(dá)載體上,經(jīng)菌落PCR初步鑒定和DNA測序無誤后成功構(gòu)建6種原核表達(dá)重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）;利用谷胱甘肽瓊脂糖樹脂與鎳柱對重組蛋白進(jìn)行純化,煙草蝕紋病毒（TEV）蛋白酶酶切掉GST或His-NusA標(biāo)簽,得到分子量約為105 kDa的HA-VPS11蛋白、97 kDa的Flag-VPS16蛋白、108 kDa的HA-VPS18蛋白、70 kDa的Flag-VPS33蛋白、97 k Da的HA-VPS39蛋白和98 kDa的Flag-VPS41蛋白;通過體外GST pull-down技術(shù)對6種蛋白的功能進(jìn)行驗(yàn)證,證實(shí)自噬性SNARE蛋白S... 

【文章來源】：生物工程學(xué)報(bào). 2020,36(01)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：10 頁

【部分圖文】：

VPS18、VPS39和VPS11基因的PCR擴(kuò)增

VPS16、VPS41和VPS33基因的PCR擴(kuò)增

經(jīng)SDS-PAGE和Western blotting方法檢測得出以下結(jié)果：利用鎳柱親和層析方式成功純化得到分子量在105 kDa左右的HA-VPS11重組蛋白、108 kDa左右的HA-VPS18重組蛋白及97 kDa左右的HA-VPS39重組蛋白(圖7)；利用谷胱甘肽親和層析方式成功純化得到分子量在97 kDa左右的Flag-VPS16重組蛋白、70 kDa左右的Flag-VPS33重組蛋白及98 kDa左右的Flag-VPS41重組蛋白(圖8)。圖4 pGEX 4T-1-GST載體圖譜

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]豬偽狂犬病毒引起PK-15細(xì)胞自噬的研究[J]. 許長萌,王志建,王咪,劉倩玉,王先煒.  南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào). 2018(04)
[2]人ATG4B的表達(dá)及蛋白純化和鑒定[J]. 黃蓉,徐小潔,梁迎春,張立,王濤,周麗英,杜楠,葉棋濃.  細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志. 2015(02)
[3]HOPS復(fù)合體蛋白在細(xì)胞自噬過程中的功能研究[J]. 胡晚秋,林志祥,陳麗蓮,晏向華,陳放.  中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào). 2011(08)



本文編號：3338267