玉米赤霉烯酮（Zearalenone,ZEN）是鐮刀菌屬產生的類雌激素毒素,可對人體及家禽造成生殖毒性、遺傳毒性、免疫毒性等多種毒性,在農作物的生長、收獲、加工、運輸及儲存過程中都可能受其污染,可在全世界范圍內對人體健康造成威脅。針對此現(xiàn)狀,本研究從生物脫毒法著手對ZEN的脫毒降解進行研究,現(xiàn)有資料表明,嗜酸乳桿菌是乳酸菌中被廣泛研究的益生菌之一,其在腸道中較強的黏附能力和較高的耐酸耐膽鹽能力,具有調節(jié)胃腸道菌群環(huán)境、提高機體免疫力、抑制致病菌等多重益生特性,在乳品、飲料、飼料等食品領域中均得到了開發(fā)應用,在醫(yī)學研究應用中也有所貢獻,基于此,本實驗選定嗜酸乳桿菌通過基因克隆手段使其獲得生物法降解ZEN的能力。本論文以實驗室已有的質粒p PIC9K-Oxa為模板,設計引物P1、P2,擴增從不動桿菌SM04分離的ZEN降解酶Oxa基因插入乳桿菌穿梭載體p MG36e中,化學法轉入E.coli JM109構建重組質粒p MG36e-Oxa,再將重組質�？寺〉绞人崛闂U菌ATCC4356中,通過重組菌的培養(yǎng)表達獲得重組蛋白,經(jīng)SDS-PAGE電泳和ZEN降解實驗對重組蛋白Oxa的表達和降解活性進... 

【文章來源】：華南理工大學廣東省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：76 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

目的基因PCR擴增產物電泳圖

第二章重組質粒pMG36e-Oxa構建17按2.2.4中的擴增條件進行菌落PCR擴增，取5μL擴增產物通過1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。將電泳結果中成功擴增出目的基因條帶的陽性轉化子分別接種到50mL含抗生素抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37°C恒溫180r/min搖床過夜培養(yǎng)，并將培養(yǎng)物按照本章2.2.2的方法提取質粒后進行雙酶切，使用1%瓊脂糖凝膠電泳觀察結果進行初步鑒定，同時將陽性重組子菌體培養(yǎng)液送至生物工程（上海）有限公司提取質粒進行測序，測序引物如表2-3所示：表2-3引物Table.2-3Primers名稱序列長度F15’-GGATTTTTGTGAGCTTGGAC-3’20bpF25’-ACCATTTGACTTTGAACCTC-3’20bp2.4實驗結果與討論2.4.1目的基因擴增及載體提取Oxa基因片段經(jīng)PCR擴增后經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，顯示所得產物條帶片段約為820bp，與引物設計擴增后所得產物長度（820bp）相符（如圖2-1所示）。將從E.coliDH5α中提取的質粒pMG36e使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，成功提取到所需載體（如圖2-2所示）。M11M22M1.2000DNAMarkerM2.5000DNAMarker1.PCR擴增產物2.質粒pMG36e條帶圖2-1目的基因PCR擴增產物電泳圖圖2-2提取質粒pMG36e條帶Fig.2-1ElectrophoresisanalysisFig.2-2Electrophoresisanalysis2.4.2重組質粒構建及鑒定將雙酶切后回收的載體片段VectorDNA（如圖2-3所示）與目的基因片段InsertDNA進行連接，構建重組質粒pMG36e-Oxa，通過化學法轉化至大腸桿菌2000100075050050003000目的基因pMG36e

華南理工大學工程碩士學位論文18后通過菌落PCR進行重組子挑選，菌落PCR產物使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖2-4所示，從含抗生素的LB平板上所選的兩個單菌落均成功擴增出了與目的基因（820bp）片段大小一致的條帶。將PCR擴增成功的轉化子單菌落接種至含有抗生素抗性標記的LB液體培養(yǎng)基中富集培養(yǎng)后提取質粒進行雙酶切鑒定，酶切產物電泳結果如圖2-5所示，雙酶切產物中含有與載體片段（3.6kb）大小相一致的條帶和與目的基因（820bp）片段大小相一致的條帶，初步證明重組質粒pMG36e-Oxa成功構建并導入至E.coliJM109中。M31234M3.23130DNAMaker1.質粒pMG36e2.質粒pMG36eSmaI單酶切3.質粒pMG36eHindШ單酶切4.質粒pMG36eSmaI、HindШ雙酶切條帶圖2-3質粒pMG36e雙酶切電泳結果Fig.2-3ElectrophoresisanalysisM212M23M2.5000DNAMarker1,2.PCR擴增產物條帶3.重組質粒雙酶切條帶圖2-4菌落PCR電泳圖圖2-5重組質粒雙酶切電泳圖Fig.2-4ElectrophoresisanalysisFig.2-5Electrophoresisanalysis同時，經(jīng)生物工程（上海）有限公司的質粒測序鑒定結果（如圖2-6所示），從102bp開始至887bp結束，為目的基因Oxa的基因序列，而102bp以前的序列及887bp以后的序列分別為兩個酶切位點序列及相對應的載體連接序列，根43612322202750003000750pMG36e目的基因目的基因雙酶切片段

【參考文獻】：
期刊論文
[1]重組ZEN降解酶Oxa的純化及特性研究[J]. 朋賢,楊繼國,朱潔盈,郭景景,唐語謙.  現(xiàn)代食品科技. 2019(05)
[2]玉米赤霉烯酮降解酶基因zhd101表達載體構建及在大腸桿菌中表達[J]. 龍淼,劉義,陳新亮,何潤霞,張燚,何劍斌,高增貴.  畜牧與獸醫(yī). 2016(01)
[3]玉米赤霉烯酮對豬的毒性作用及其生物降解研究進展[J]. 陳繼發(fā),張佳鑫,曲湘勇,彭豫東.  中國飼料. 2015(19)
[4]可降解玉米赤霉烯酮的重組過氧化物酶A4-Prx的純化與活性研究[J]. 鐘鳳,吳暉,劉思利,唐語謙.  現(xiàn)代食品科技. 2015(08)
[5]飼料中玉米赤霉烯酮脫毒技術研究[J]. 李溪,王金榮,趙銀麗,蘇蘭利,朱雪飛,陳培英.  飼料研究. 2015(13)
[6]表達鼠源GLP-2重組嗜酸乳桿菌的構建[J]. 白云,韓博,栗楠,嚴軒,謝姍姍,劉殿峰,姜云壘.  中國獸醫(yī)學報. 2015(05)
[7]表達EPEC緊密素蛋白重組嗜酸乳酸桿菌的免疫效果檢測[J]. 郝鳳奇,李景梅,楊洲紅.  西北農林科技大學學報(自然科學版). 2015(06)
[8]雞源性嗜酸乳桿菌對肉雞小腸黏膜免疫相關細胞的影響[J]. 祁鳳華,扇玉斌,周立強,徐春生,張文舉.  石河子大學學報(自然科學版). 2015(01)
[9]嗜酸乳桿菌對黃羽肉雞生長性能及營養(yǎng)物質代謝率的影響[J]. 祁鳳華,周立強,馬紅,徐春生.  畜牧與獸醫(yī). 2014(04)
[10]飼料和原料中玉米赤霉烯酮的危害及檢測方法探討[J]. 侯月娥,姜瑞麗,李旭寧,田書會.  當代畜牧. 2014(03)

博士論文
[1]豬流行性腹瀉病毒S基因變異分析及嗜酸乳桿菌口服疫苗的研究[D]. 張月.山東農業(yè)大學 2016

碩士論文
[1]Pichia Pastoris分泌表達A4-Oxa酶及降解玉米赤霉烯酮的研究[D]. 劉思利.華南理工大學 2017
[2]飼用抑菌活性乳酸菌共培養(yǎng)篩選、優(yōu)化及抗性分析[D]. 徐秀偉.安徽農業(yè)大學 2016
[3]高效表達抗菌肽PNK-19的嗜酸乳桿菌表達體系的建立[D]. 趙志雨.河南科技學院 2014
[4]動物腸道中嗜酸乳桿菌粘附作用研究[D]. 李振梅.山東師范大學 2007



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