骨骼肌是哺乳動(dòng)物機(jī)體重要的運(yùn)動(dòng)器官,約占人體總質(zhì)量的40%。骨骼肌的生長(zhǎng)和損傷后修復(fù),對(duì)人體正常生理功能的維持具有重要意義。肌衛(wèi)星細(xì)胞（Muscle satellite cells,SCs）是骨骼肌系統(tǒng)中具有長(zhǎng)期自我更新和分化潛能的成體干細(xì)胞,起源于胚胎中胚層。在發(fā)育成熟的個(gè)體,SCs位于基膜與肌細(xì)胞膜之間,大多數(shù)處于靜息狀態(tài)。當(dāng)肌肉受到損傷等刺激時(shí),SCs被激活并開(kāi)始增殖,增殖后的SCs一部分繼續(xù)分化為肌細(xì)胞,形成肌束,以修復(fù)肌肉組織的損傷,另一部分則重新進(jìn)入靜息狀態(tài)以維持干細(xì)胞池�？梢�(jiàn),SCs在靜止、增殖和分化之間的平衡轉(zhuǎn)變對(duì)于干細(xì)胞池的維持和肌肉的穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。近來(lái)不斷有研究揭示多種轉(zhuǎn)錄因子、非編碼RNA、多種激酶及表觀修飾因子在SCs功能調(diào)控中的重要作用,但SCs的內(nèi)在調(diào)控網(wǎng)絡(luò)尚未完全解析。因此,深入挖掘調(diào)控SCs的分子網(wǎng)絡(luò),將有助于加深對(duì)SCs功能維持及骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育的理解。FoxM1（Forkhead box protein M1）是叉頭框蛋白家族成員,被鑒定為原癌基因,其在細(xì)胞增殖及腫瘤發(fā)生等方面發(fā)揮重要作用�，F(xiàn)有研究揭示FoxM1主要通過(guò)轉(zhuǎn)錄調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá),... 

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

SCs特異性FoxM1敲除小鼠模型構(gòu)建策略

第3章FoxM1缺失對(duì)小鼠肌肉生長(zhǎng)發(fā)育與再生功能的影響19雜交，選取FoxM1fl/+-Pax7-Cre小鼠與FoxM1fl/fl交配，得到FoxM1fl/fl-Pax7-Cre小鼠。FoxM1fl/fl-Pax7-Cre與FoxM1fl/fl交配，后代基因型FoxM1fl/fl-Pax7-Cre的小鼠作為實(shí)驗(yàn)鼠，同窩同性別，基因型為FoxM1fl/fl的小鼠作為對(duì)照鼠。FoxM1fl/+小鼠攜帶FoxM1基因座，外顯子4至7兩側(cè)有兩個(gè)loxp位點(diǎn)，在Pax7啟動(dòng)子控制下，Cre重組酶表達(dá)后，切除FoxM1第4-7外顯子，實(shí)現(xiàn)在SCs中特異性敲除FoxM1，如圖3.1所示。圖3.1SCs特異性FoxM1敲除小鼠模型構(gòu)建策略Fig.3.1ConstructionstrategyofSCsspecificFoxM1knockoutmousemodel3.4.2SCs特異性FoxM1敲除小鼠的鑒定實(shí)驗(yàn)中獲得的FoxM1fl/fl-Pax7-Cre小鼠，用FoxM1-cKO小鼠來(lái)表示（下文中均以此代表SCs特異性FoxM1敲除小鼠）。取分離培養(yǎng)的FoxM1+/+、FoxM1fl/fl和FoxM1-cKO小鼠的SCs，堿裂解法裂解細(xì)胞釋放基因組DNA，采用基因分型PCR鑒定小鼠基因型（引物設(shè)計(jì)思路見(jiàn)圖3.1），WT基因鑒定條帶：220bp，fl/fl基因鑒定條帶：280bp，敲除鑒定基因：400bp。如圖3.2，結(jié)果顯示我們的小鼠構(gòu)建策略的有效性。圖3.2SCs特異性FoxM1敲除小鼠基因型鑒定Fig.3.2GenotypingofSCs-specificFoxM1knockoutmice.

西南大學(xué)碩士學(xué)位論文203.4.3SCs特異性FoxM1敲除效率的檢測(cè)為了進(jìn)一步探究FoxM1在SCs中的敲除效率，我們通過(guò)流式分選法獲得FoxM1fl/fl和FoxM1-cKO小鼠SCs，提取RNA并進(jìn)行RT-qPCR實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示在FoxM1-cKO小鼠SCs中FoxM1的表達(dá)顯著降低（圖3.3A）。此外我們通過(guò)組織培養(yǎng)法分離SCs，在體外培養(yǎng)后裂解細(xì)胞并利用Westernblot分析FoxM1的表達(dá)情況，結(jié)果也證實(shí)了FoxM1的敲除效率（圖3.3B）。以上結(jié)果表明SCs特異性FoxM1敲除小鼠模型構(gòu)建成功。圖3.3SCs中FoxM1特異性敲除效率檢測(cè)（A）RT-qPCR檢測(cè)mRNA水平FoxM1的表達(dá)。（B）Westernblot法測(cè)定蛋白水平FoxM1和Tubulin（內(nèi)參）的表達(dá)。（誤差條表示平均值±SD。**p<0.01；t-test）。Fig.3.3DetectionofFoxM1specificknockoutefficiencyinSCs.(A)QuantitativeRT-PCRanalysisofFoxM1expressioninmRNAlevel.(B)ExpressionsofFoxM1andTubulin(loadingcontrol)weredeterminedbywesternblotanalysisatproteinlevel.(Errorbarsrepresentthemeans±SD.**p<0.01;Student’st-test).3.4.4FoxM1缺失導(dǎo)致肌肉萎縮分別取適齡FoxM1fl/fl小鼠和FoxM1-cKO小鼠TA進(jìn)行視覺(jué)觀察，用微量天平稱重，發(fā)現(xiàn)2月齡FoxM1-cKO小鼠的TA重量較對(duì)照組無(wú)明顯的差異（圖3.4B），但在8月齡時(shí)FoxM1-cKO小鼠TA質(zhì)量有所下降（圖3.4C）。消化處理肌肉組織，分離獲得EDL單根肌纖維，固定后利用DAPI染色，統(tǒng)計(jì)單根肌纖維上肌細(xì)胞核的數(shù)目，結(jié)果顯示，2月齡FoxM1-cKO小鼠肌肉組織中肌細(xì)胞核的數(shù)量與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異（圖3.5B），但8月齡FoxM1-cKO小鼠的肌細(xì)胞核的數(shù)量減少（圖3.5C）。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]肌源性干/祖細(xì)胞對(duì)造血干細(xì)胞分化、支持的研究進(jìn)展[J]. 古晶晶,鄭波.  重慶醫(yī)學(xué). 2019(07)
[2]MicroRNA調(diào)控哺乳動(dòng)物骨骼肌發(fā)育[J]. 李新云,付亮亮,程會(huì)軍,趙書(shū)紅.  遺傳. 2017(11)



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