目的:利用CRISPR/Cas9（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9）系統(tǒng)構(gòu)建玉米中心蛋白（Centrin）的表達(dá)載體,經(jīng)轉(zhuǎn)化后分析其對(duì)玉米生長(zhǎng)發(fā)育的影響。方法:針對(duì)ZmCen基因的第一個(gè)外顯子設(shè)計(jì)sgRNA,將其連入pOMS01-Cas9-ZmCensgRNA表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101后,侵染玉米自交系材料B104的愈傷組織,經(jīng)繼代、誘導(dǎo)、分化成苗,篩選出轉(zhuǎn)基因后代。對(duì)T₀代和T₁代基因組DNA進(jìn)行PCR驗(yàn)證、測(cè)序及表型分析。結(jié)果:成功構(gòu)建ZmCen的表達(dá)載體。侵染農(nóng)桿菌后,PCR測(cè)序顯示,T₀代和T₁代突變率分別為20.13%和64.52%,其中T₁代的純合缺失突變率為5%。序列分析表明,ZmCen基因的編輯靶點(diǎn)附近發(fā)生了堿基的替換、插入或缺失。經(jīng)與野生型表型比對(duì)發(fā)現(xiàn),ZmCen突變體T₁代植株出現(xiàn)發(fā)育緩慢且雄花... 

【文章來(lái)源】：中國(guó)生物工程雜志. 2020,40(12)北大核心CSCD

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【部分圖文】：

Zm Cen基因結(jié)構(gòu)、靶標(biāo)導(dǎo)向RNA的設(shè)計(jì)及p OMS01-Cas9-Zm Cen-gRNA載體構(gòu)建及鑒定

經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的T0代再生植株，首先采用轉(zhuǎn)基因抗除草劑Bar基因檢測(cè)試紙條對(duì)T0代CRISPR/Cas9基因編輯玉米植株進(jìn)行初步篩選。結(jié)果獲得基因編輯載體的玉米植株，試紙條顯示兩條條帶為陽(yáng)性(+);野生型及未獲得基因編輯載體的玉米植株只顯示一條條帶，為陰性(-)(圖2a)。同時(shí)對(duì)T0代玉米提取基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物送公司測(cè)序分析(圖2b)，測(cè)序結(jié)果與野生型玉米自交系B104的基因組DNA擴(kuò)增結(jié)果序列比對(duì)如圖3所示。

次年種植T0代種子，繼續(xù)自交并結(jié)實(shí)，收獲轉(zhuǎn)基因植株。檢測(cè)T1代轉(zhuǎn)基因植株Zm Cen的突變情況，同時(shí)對(duì)T1代進(jìn)行PCR擴(kuò)增，與T0代產(chǎn)物測(cè)序比對(duì)分析(圖3)，結(jié)果T0代和T1代均發(fā)生不同類型的堿基插入、缺失及替換。其中T0代最大缺失37bp(圖3:T0-4);在62株T1代植株中，有10株發(fā)生單堿基插入突變，占總檢測(cè)植株(62株)的16.13%，主要是堿基C的插入;11株發(fā)生堿基缺失突變，占總檢測(cè)植株的17.74%,19株發(fā)生堿基替換突變，大部分為單堿基T的插入，占總檢測(cè)植株的30.64%。其中純合突變有“3”株，純合突變率為5%(表3)。2.3 外源轉(zhuǎn)化元件在純合突變體中的分離鑒定

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]玉米酵母雙雜交cDNA文庫(kù)的構(gòu)建及ZmCEN互作蛋白的篩選[J]. 雷海英,白鳳麟,段永紅,王志軍.  西北植物學(xué)報(bào). 2018(04)



本文編號(hào)：3329714