本文對于變性泡介導的鏈交換擴增（Strand Exchange Amplification,SEA）引物設(shè)計規(guī)則和快速SEA（accelerated SEA,ASEA）初步應(yīng)用和核酸雜交特異性進行初步研究,主要的研究內(nèi)容與結(jié)論如下:1.SEA引物設(shè)計策略:利用一系列Tm值的肺炎支原體引物研究引物Tm值與反應(yīng)溫度的最優(yōu)組合;通過具有不同Tm值差異的沙眼衣原體和家豬引物的擴增效率研究引物Tm差異對擴增效率的影響;設(shè)計肺炎支原體和沙眼衣原體引物研究G/C含量對擴增效率的影響;根據(jù)沙眼衣原體和單增李斯特菌引物的擴增效率研究引物自身互補和3’端互補對擴增效率的影響;根據(jù)金黃色葡萄球菌的擴增效率確定引物Tm值和3’末端G/C含量的優(yōu)先級。結(jié)果:引物Tm值及反應(yīng)溫度均為61℃時,SEA有最高的擴增效率;Tm值差異最小的引物對的閾值時間（Threshold time,Tt）值最低,而Tm值差異最大的引物對的Tt值最高;3’端G/C含量較高的引物表現(xiàn)出較低的Tt值;互補位點的數(shù)目與Tt值呈正相關(guān),引物擁有的總潛在互補位點最少,Tt值最低;Tm值和Tm值的差異應(yīng)優(yōu)先于3’端G/C含量。結(jié)論:SEA引物設(shè)計... 

【文章來源】：青島大學山東省

【文章頁數(shù)】：61 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

1LAMP反應(yīng)原理

青島大學碩士學位論文4具有更高的靈敏度和特異性，對PCR抑制劑也顯示出更高的耐受度，得到了廣泛的認可。LMAP反應(yīng)含有6條引物和具有鏈置換活性的Bst聚合酶，反應(yīng)首先通過兩個內(nèi)部引物和兩個外部引物形成啞鈴狀的基本反應(yīng)單元；然后通過環(huán)狀引物加速反應(yīng)，環(huán)狀引物能夠?qū)AMP反應(yīng)速度提高兩倍。4到6條引物對應(yīng)DNA序列中6至8個不同的區(qū)域，這顯示出其他檢測方法不具有的出色的特異性，LAMP原理圖如圖1.1所示。LAMP近幾年廣泛應(yīng)用于食品安全、癌癥及傳染性疾病檢測中，顯示出良好的應(yīng)用前景。通過額外添加中性紅、鈣黃綠素及金納米顆粒等試劑建立的可視化檢測手段，使得LAMP反應(yīng)成為更適用于基層單位的核酸檢測手段[24-26]。然而LAMP的易污染特性也飽受詬病，由于高靈敏度即使存在較低濃度的污染也能夠造成假陽性報告，有課題組嘗試在引物中加入特定酶切位點，在反應(yīng)前對體系中存在的污染進行酶切，而額外的內(nèi)切酶在LAMP反應(yīng)溫度下失去活性，不會對反應(yīng)產(chǎn)生影響，顯示出良好的抗污染特性[27]。LAMP反應(yīng)體系中存在大量的引物這使得引物之間很可能會形成二聚體，直接影響LAMP反應(yīng)的擴增效率。EryuWang教授詳細的探討引物二聚體對LAMP反應(yīng)擴增效率的影響，并提出了計算非特異性擴增吉布斯自由能變化的公式，提供LAMP引物設(shè)計的理論指導[28]。1.1.2.2變性泡介導的等溫核酸擴增反應(yīng)圖1.1.2變性泡介導的等溫核酸擴增原理圖[31]Figure1.1.2theprincipleofdenaturationbubble-meditatedisothermalstrandexchangeamplification變性泡介導的等溫核酸擴增是石超教授課題組在2016年提出使用具有鏈置換活性的DNA聚合酶在DNA雙鏈的呼吸作用下，進行核酸擴增[29]。該方法只使一對引物，相比較LAMP反應(yīng)3對引物而言更不容易產(chǎn)生引物二聚體，引物設(shè)計更為容

青島大學碩士學位論文61.2.1.2二元探針圖1.2.1二元探針反應(yīng)原理圖[41]Figure1.2.1Schematicdiagramofbinaryprobereaction二元探針是核酸探針中重要的一員，它是在直鏈探針的基礎(chǔ)之上設(shè)計而來。標準的二元探針由兩段短的核苷酸組成，并在探針末端標記上熒光供體和熒光受體，當反應(yīng)體系中不存在靶標時，探針隨機分布在溶液中，只有熒光供體能發(fā)出熒光；當反應(yīng)體系中存在靶標時，識別相鄰區(qū)域的兩段探針被靶標拉近，通過能量共振轉(zhuǎn)移作用使熒光受體發(fā)出熒光信號[42-43],二元探針反應(yīng)原理圖如圖2.1所示。只有當兩條探針識別特異序列彼此接近時，探針才能發(fā)出檢測信號，而兩條鏈結(jié)合到同一個非特異性靶標的可能性極低，因此二元探針具有較高的特異性。為了提高二元探針的信噪比NicholasJTurro等人開發(fā)了三染料二元探針，他們將FRET染料對和熒光受體分別標記在兩條探針上，有效的提高了二元探針的信噪比[44]。二元探針分段式的設(shè)計，使得只有兩個探針同時結(jié)合與同一個靶標時才能報告檢測信號，這使得二元探針的雜交效率比直鏈探針更低，為此WeihongTan等人將二條探針用聚乙二醇（PEG）聚合物鏈連接，在保留二元探針高特異性的同時，提高了二元探針的雜交效率[45]。1.2.1.3分子信標分子信標（MB）是由一條核酸鏈形成的一種常見核酸探針。分子信標的環(huán)狀部位為核酸識別區(qū)域用于識別并與特定序列結(jié)合的區(qū)域，在環(huán)狀部位的兩端具有5到6個互補堿基，當反應(yīng)體系中不存在靶標時末端互補堿基互補結(jié)合使核酸鏈形成發(fā)卡狀，將標記在核酸鏈末端的熒光基團和淬滅基團拉近，從而不會導致熒光發(fā)射；

【參考文獻】：
碩士論文
[1]基于鏈交換擴增新方法對肺炎支原體核酸快速檢測方法的研究[D]. 史文強.青島大學 2019



本文編號：3286594