本文介紹了包括鏈置換擴增法、滾環(huán)擴增法、環(huán)介導等溫擴增技術以及工具酶法在內的等溫信號放大檢測方法,并詳細闡述了鏈置換擴增法和環(huán)介導等溫擴增技術的原理、一種進行三重信號放大的新型滾環(huán)擴增策略以及脫氧核糖轉移酶催化的新型生物條形碼放大技術,并例舉了一些以DNA銀簇為免標記信號的等溫放大檢測方法的設計策略,對免標記信號的優(yōu)點以及DNA銀簇的研究價值進行了總結和展望. 

【文章來源】：分子科學學報. 2020,36(02)北大核心

【文章頁數(shù)】：7 頁

【部分圖文】：

SDA原理和RCA三重信號放大原理

如圖1b所示,文獻[7]設計了一種基于RCA的高靈敏端粒酶熒光檢測方法,端粒酶可以在染色體DNA端粒末端添加(TTAGGG)n的重復序列,大量的(TTAGGG)重復序列被不斷地連接到引物的3"端,形成長鏈ssDNA;有AP位點(無嘌呤/嘧啶位點)并被—NH2修飾的輔助探針與ssDNA雜交并被特異性的AP內切酶剪切,生成含3"—OH端的新DNA引物進一步與環(huán)狀模板雜交并啟動RCA過程,最后含AP位點的熒光標記探針與RCA產(chǎn)物結合并產(chǎn)生熒光信號,該三重信號放大檢測方法具有超高靈敏度,可測到1個Hela細胞中的端粒酶活性.文獻[8]設計了基于RCA的檢測5-羥甲基胞嘧啶DNA(5hmC-DNA)高靈敏性免標記熒光檢測方法,引物DNA中的5hmC與KRuO4反應后,在堿性條件下被亞硫酸鹽氧化生成尿嘧啶(U),進而與含腺嘌呤(A)堿基的RCA模板互補,在連接酶和聚合酶共同作用下,啟動RCA,實現(xiàn)信號放大檢測,方法的檢測限低至34.8×10-15 mol·L-1.LAMP是基于Bst DNA聚合酶開發(fā)的高靈敏高特異性的核酸擴增技術[9],如圖2所示,巧妙設計的含互補序列的可形成環(huán)結構的引物是LAMP設計的關鍵,這使得其能夠進行非退火結合.Bst DNA聚合酶具有強的鏈置換活性,能夠沿模板進行聚合,延長引物并在新引物合成過程中替換上一條鏈,產(chǎn)生DNA擴增輸出,整個過程不需要繁瑣的熱循環(huán),可以在不到1 h內產(chǎn)生超過109份新鏈.此外,由于在引物上使用6個不同的探測序列,基于LAMP技術的檢測方法表現(xiàn)出比PCR方法更高的特異性.等溫信號放大檢測方法除借助上述熟知的擴增技術以外,還可通過設計工具酶輔助的循環(huán)放大策略,實現(xiàn)信號放大檢測.分子生物學中許多有特異活性的工具酶,如核酸外切酶1(Exo Ⅰ)[10]、核酸外切酶3(Exo Ⅲ)[11]、λ外切酶(λexo)[12]、脫氧核糖核酸酶(DNase I)[13]、限制性內切酶(NEase)[14]、聚合酶(Polymerase)[15]、連接酶(Ligase)[16]和核糖核酸酶H(RNase H)[17]等分別被用于設計不同的循環(huán)放大策略,構建熒光、比色和電化學等高靈敏檢測方法.如以miRNA為檢測對象,基于聚集誘導發(fā)光現(xiàn)象,構建了Exo Ⅲ輔助循環(huán)放大熒光檢測方法[18],檢測限達到了1.0×10-17 (4 ℃)和1.0×10-12 mol·L-1 (37 ℃),并成功應用于膀胱癌病人尿液中的miRNA檢測.使用硫堇標記的DNA探針和絲網(wǎng)印刷碳電極,基于氧化石墨烯對ssDNA的吸附作用和酶切保護作用,構建的基于DNase I輔助循環(huán)放大策略的電化學檢測方法[19],對食品中赭曲霉素A的檢測限低至5.6×10-12 g·mL-1.以腺苷為檢測對象,使用FAM熒光染料標記的DNA探針和二維納米材料氧化石墨烯,構建的基于適配體-配體相互作用的Exo I輔助循環(huán)放大高靈敏熒光檢測方法[20],相比非酶輔方法(檢測限21.2 ×10-6 mol·L-1)的檢測限低至3.1×10-6 mol·L-1.以三磷酸腺苷(ATP)為檢測對象,使用巰基和亞甲基藍修飾的DNA探針,基于適配體-配體結合誘導構象變化,構建的Nb.BbvCl輔助放大電化學檢測方法[21],ATP的線性區(qū)間為1.0×10-8～1.0×10-6 mol·L-1,檢測限低至3.4×10-9 mol·L-1.文獻[22]發(fā)展了一種無需DNA模板,只需要借助末端脫氧核糖轉移酶(TDT)催化延伸的生物條形碼放大技術(BCA),該信號放大技術包含2個重要部分,即帶有寡核糖核苷酸的磁球和表面分別修飾富A堿基A-DNA及富鳥嘌呤(G)堿基的信號G-DNA的納米金.在TDT的催化下寡核糖核苷酸延伸,產(chǎn)生富含胸腺嘧啶(T)堿基序列的ssDNA與A-DNA雜交,隨后G-DNA在TDT的催化下延伸,形成富G四鏈體結構的長鏈并與氯化血紅素輔助因子結合,催化過氧化氫介導的魯米諾氧化反應生成強熒光信號.基于BCA技術的檢測方法顯示出超高效率,且檢測限低至5.0×10-19 mol·L-1.

核酸擴增技術與基于工具酶的循環(huán)放大策略各有優(yōu)缺點,具體選擇哪一種取決于檢測對象和信號輸出的方式.基于核酸擴增技術的信號放大檢測方法信號輸出一般是從弱到強、從無到有;基于工具酶的放大檢測方法信號輸出一般是從抑制到回復.但是從最近的文獻來看,往往是同時采用核酸擴增技術和工具酶輔助循環(huán)放大策略,實現(xiàn)超高靈敏檢測.2 以DNA銀簇為免標記輸出信號的檢測方法

【參考文獻】：
期刊論文
[1]基于鏈置換擴增反應與DNA銀簇的免標記核酸檢測方法[J]. 張瑤,成玉梁,謝云飛,姚衛(wèi)蓉,郭亞輝,錢和.  武漢大學學報(理學版). 2018(04)



本文編號：3269593