赤霉�。‵usarium Head Blight,簡稱FHB）是一種在全球范圍內(nèi)流行的植物病害,對小麥產(chǎn)量造成了巨大影響。赤霉病也會引起食品安全風(fēng)險,因為致病的鐮刀菌可以合成脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol,DON）及其衍生物3-Ac DON、15-Ac DON等毒素。Tir8是參與鐮刀菌毒素合成的關(guān)鍵基因之一。不同類型Tri8蛋白可以催化不同的脫乙酰基位點,從而產(chǎn)生不同類型的DON毒素。比如亞洲鐮刀菌株Fa1312編碼的Tri8蛋白能夠催化中間體3,15-di Ac DON在15位碳原子處脫乙�；纬�3-Ac DON;而禾谷鐮刀菌Fg1230的Tri8蛋白則催化該中間體3位碳原子處脫乙酰基形成15-Ac DON。表達(dá)純化Tri8蛋白,分析其結(jié)構(gòu)及催化特征,將有利于其作用機制的闡明,有助于小麥赤霉病及其引起的糧食毒素污染問題的防控。本論文研究包括以下幾個方面的工作:（一）建立了Tri8蛋白原核表達(dá)純化體系。通過PCR擴增獲得Tri8基因并構(gòu)建原核表達(dá)載體,將其導(dǎo)入大腸桿菌ER2566進行誘導(dǎo)表達(dá)。為便于純化,融合蛋白帶有MBP和His-tag標(biāo)簽,利用直鏈淀粉柱親和層析... 

【文章來源】：西北農(nóng)林科技大學(xué)陜西省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：78 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

不同化學(xué)型赤霉菌毒素的合成途徑Figure1-1SyntheticrouteofdifferentchemotypeGibberellatoxin

西北農(nóng)林科技大學(xué)碩士學(xué)位論文103-AcDON酶切的片段大小大約是515bp和540bp（劉楊楊等2018）。1.5本研究的意義和目的小麥鐮刀菌毒素DON以其前體形式3,15-diAcDON分泌，在細(xì)胞外被Tri8所編碼的脂酶活化，進而形成不同化學(xué)型的DON毒素，即不同菌株中的Tri8蛋白可以催化不同的脫乙�；饔茫a(chǎn)生不同類型的DON毒素（AlexanderNJ.etal.，2011）。本研究擬建立Tri8蛋白的原核表達(dá)純化體系，為通過生物化學(xué)和結(jié)構(gòu)生物學(xué)方法研究Tri8蛋白催化機制奠定基矗同時該研究擬通過基因敲除和基因過量表達(dá)分別獲得Tri8基因敲除株系和同時含有兩種類型Tri8基因的過表達(dá)株系。利用這兩種株系可以進一步確證Tri8的生物學(xué)功能，而且利用它們可以制備毒素前體3,15-diAcDON和毒素DON，為后續(xù)Tri8蛋白催化動力學(xué)研究及DON毒素檢測提供支持。1.6技術(shù)路線圖圖1-2技術(shù)路線圖Figure1-2Technologyroadmap

第二章Tri8基因的原核表達(dá)19圖2-1Tri8基因擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析泳道M為DNAladder;泳道1為Tri8基因擴增產(chǎn)物Figure2-1AnalysisoftheamplifiedproductofTri8byAgaroseGelelectrophoresisThelaneMis1kbDNAladder;Thelane1istheamplifiedproductofTri8.2.3.2Tri8基因原核表達(dá)載體構(gòu)建XhoI、EcoRI雙酶切Tri8基因擴增片段和原核表達(dá)載體pET-21aHMT，凝膠回收酶切產(chǎn)物并進行連接反應(yīng)，隨后轉(zhuǎn)化克隆菌株DH5。挑取單克隆菌落，采用Tri8基因上下游引物（Tri8-F/Tri8-R）進行菌落PCR篩選，擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖2-2所示，出現(xiàn)了符合預(yù)期的1400bp左右條帶。隨后對重組的原核表達(dá)載體進行進一步酶切和測序驗證，驗證正確后的質(zhì)粒保存?zhèn)溆�。圖2-1Tri8基因擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析泳道M為DNAladder;泳道1為Tri8基因擴增產(chǎn)物Figure2-1AnalysisoftheamplifiedproductofTri8byAgaroseGelelectrophoresisThelaneMis1kbDNAladder;Thelane1istheamplifiedproductofTri8.


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