赤霉�。‵usarium Head Blight,簡稱FHB）是一種在全球范圍內流行的植物病害,對小麥產量造成了巨大影響。赤霉病也會引起食品安全風險,因為致病的鐮刀菌可以合成脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol,DON）及其衍生物3-Ac DON、15-Ac DON等毒素。Tir8是參與鐮刀菌毒素合成的關鍵基因之一。不同類型Tri8蛋白可以催化不同的脫乙�；稽c,從而產生不同類型的DON毒素。比如亞洲鐮刀菌株Fa1312編碼的Tri8蛋白能夠催化中間體3,15-di Ac DON在15位碳原子處脫乙�；纬�3-Ac DON;而禾谷鐮刀菌Fg1230的Tri8蛋白則催化該中間體3位碳原子處脫乙酰基形成15-Ac DON。表達純化Tri8蛋白,分析其結構及催化特征,將有利于其作用機制的闡明,有助于小麥赤霉病及其引起的糧食毒素污染問題的防控。本論文研究包括以下幾個方面的工作:（一）建立了Tri8蛋白原核表達純化體系。通過PCR擴增獲得Tri8基因并構建原核表達載體,將其導入大腸桿菌ER2566進行誘導表達。為便于純化,融合蛋白帶有MBP和His-tag標簽,利用直鏈淀粉柱親和層析... 

【文章來源】：西北農林科技大學陜西省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數】：78 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

不同化學型赤霉菌毒素的合成途徑Figure1-1SyntheticrouteofdifferentchemotypeGibberellatoxin

西北農林科技大學碩士學位論文103-AcDON酶切的片段大小大約是515bp和540bp（劉楊楊等2018）。1.5本研究的意義和目的小麥鐮刀菌毒素DON以其前體形式3,15-diAcDON分泌，在細胞外被Tri8所編碼的脂酶活化，進而形成不同化學型的DON毒素，即不同菌株中的Tri8蛋白可以催化不同的脫乙�；饔茫a生不同類型的DON毒素（AlexanderNJ.etal.，2011）。本研究擬建立Tri8蛋白的原核表達純化體系，為通過生物化學和結構生物學方法研究Tri8蛋白催化機制奠定基矗同時該研究擬通過基因敲除和基因過量表達分別獲得Tri8基因敲除株系和同時含有兩種類型Tri8基因的過表達株系。利用這兩種株系可以進一步確證Tri8的生物學功能，而且利用它們可以制備毒素前體3,15-diAcDON和毒素DON，為后續(xù)Tri8蛋白催化動力學研究及DON毒素檢測提供支持。1.6技術路線圖圖1-2技術路線圖Figure1-2Technologyroadmap

第二章Tri8基因的原核表達19圖2-1Tri8基因擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳分析泳道M為DNAladder;泳道1為Tri8基因擴增產物Figure2-1AnalysisoftheamplifiedproductofTri8byAgaroseGelelectrophoresisThelaneMis1kbDNAladder;Thelane1istheamplifiedproductofTri8.2.3.2Tri8基因原核表達載體構建XhoI、EcoRI雙酶切Tri8基因擴增片段和原核表達載體pET-21aHMT，凝膠回收酶切產物并進行連接反應，隨后轉化克隆菌株DH5。挑取單克隆菌落，采用Tri8基因上下游引物（Tri8-F/Tri8-R）進行菌落PCR篩選，擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳結果如圖2-2所示，出現了符合預期的1400bp左右條帶。隨后對重組的原核表達載體進行進一步酶切和測序驗證，驗證正確后的質粒保存?zhèn)溆�。圖2-1Tri8基因擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳分析泳道M為DNAladder;泳道1為Tri8基因擴增產物Figure2-1AnalysisoftheamplifiedproductofTri8byAgaroseGelelectrophoresisThelaneMis1kbDNAladder;Thelane1istheamplifiedproductofTri8.


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