蜂房哈夫尼亞菌（Hafnia alvei）是一種桿狀革蘭氏陰性細(xì)菌,為腸桿菌科哈夫尼亞菌屬的代表性細(xì)菌。因其具有嗜冷、喜好厭氧潮濕環(huán)境等特點(diǎn),常常成為低溫貯藏食品中的特定腐敗菌（Specific Spoilage Organisms,SSO）。研究表明,其致腐行為受由N-�；�-高絲氨酸內(nèi)酯（N-acyl-homoserine lactones,AHLs）介導(dǎo)的lux型群體感應(yīng)系統(tǒng)的調(diào)控。因此,本文以腐敗大菱鲆中分離純化得到的一株蜂房哈夫尼亞菌Ha-01為研究對象,通過基因工程和生物信息學(xué)等技術(shù)研究其菌株內(nèi)的lux型群體感應(yīng)調(diào)控基因halI/R,初步探究二者編碼的HalI/R蛋白的功能性質(zhì),并討論二者能否對蜂房哈夫尼亞菌生物膜的形成起到調(diào)控作用。研究旨在探討由群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)的魚類腐敗機(jī)制,為建立以靶向控制群體感應(yīng)系統(tǒng)為基礎(chǔ)的水產(chǎn)品保鮮新技術(shù)提供理論依據(jù)。1.根據(jù)GenBank中登錄halI/R基因序列設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增全長引物,利用TA克隆技術(shù)構(gòu)建克隆載體pMD-halI和pMD-halR,并導(dǎo)入宿主E.coli JM109中大量擴(kuò)增;后經(jīng)測序及BLAST比對分析,結(jié)果顯示由蜂房哈夫尼亞菌... 

【文章來源】：渤海大學(xué)遼寧省

【文章頁數(shù)】：91 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第一章 緒論
    1.1 群體感應(yīng)現(xiàn)象
        1.1.1 群體感應(yīng)的發(fā)現(xiàn)
        1.1.2 群體感應(yīng)的類型
    1.2 群體感應(yīng)相關(guān)蛋白及其分子機(jī)制
        1.2.1 LuxI-type信號分子合成酶
        1.2.2 LuxR-type轉(zhuǎn)錄因子
        1.2.3 LuxR-type轉(zhuǎn)錄因子與AHL分子及靶基因的相互作用
    1.3 群體感應(yīng)與水產(chǎn)品腐敗
        1.3.1 水產(chǎn)品特定腐敗菌
        1.3.2 水產(chǎn)腐敗菌的QS系統(tǒng)
        1.3.3 水產(chǎn)品致腐因子與群體感應(yīng)
    1.4 研究的主要內(nèi)容、目的及意義
第二章 大菱鲆源蜂房哈夫尼亞菌群體感應(yīng)基因的克隆
    2.1 前言
    2.2 材料與儀器
        2.2.1 實(shí)驗(yàn)菌株及培養(yǎng)條件
        2.2.2 質(zhì)粒與引物
        2.2.3 主要試劑
        2.2.4 主要儀器
    2.3 實(shí)驗(yàn)方法
        2.3.1 菌種活化
        2.3.2 蜂房哈夫尼亞菌Ha-01基因組DNA提取
        2.3.3 引物設(shè)計(jì)及合成
        2.3.4 蜂房哈夫尼亞菌Ha-01目的基因halI/R的 PCR擴(kuò)增
        2.3.5 瓊脂糖凝膠電泳
        2.3.6 克隆載體的構(gòu)建
        2.3.7 陽性克隆子的篩選、鑒定與質(zhì)粒抽提
        2.3.8 克隆載體測序及序列比對
    2.4 結(jié)果與討論
        2.4.1 蜂房哈夫尼亞菌Ha-01目的基因halI/R的PCR擴(kuò)增與產(chǎn)物純化
        2.4.2 陽性轉(zhuǎn)化子E.coli JM109(pMD-halI,pMD-halR)的篩選
        2.4.3 陽性轉(zhuǎn)化子E.coli JM109(pMD-halI,pMD-halR)的鑒定
        2.4.4 陽性克隆質(zhì)粒pMD-halI,pMD-halR的測序結(jié)果
        2.4.5 目的片段的序列比對結(jié)果
    2.5 小結(jié)
第三章 蜂房哈夫尼亞菌群體感應(yīng)基因halI/R的生物信息學(xué)分析
    3.1 前言
    3.2 實(shí)驗(yàn)材料與分析工具
        3.2.1 halI和halR的核酸序列
        3.2.2 生物信息學(xué)分析工具
    3.3 實(shí)驗(yàn)方法
        3.3.1 HalI/R蛋白一級結(jié)構(gòu)的確定
        3.3.2 HalI/R蛋白的序列比對分析
        3.3.3 HalI/R蛋白理化性質(zhì)的預(yù)測
        3.3.4 HalI/R蛋白的功能性預(yù)測
        3.3.5 HalI/R蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測
        3.3.6 HalI/R蛋白的三維構(gòu)象預(yù)測
        3.3.7 蛋白間的相互作用研究
        3.3.8 蛋白表達(dá)系統(tǒng)的選擇
    3.4 結(jié)果與討論
        3.4.1 HalI/R蛋白一級結(jié)構(gòu)的確定
        3.4.2 HalI/R蛋白的BLAST分析
        3.4.3 HalI/R蛋白理化性質(zhì)的預(yù)測
        3.4.4 HalI/R蛋白功能預(yù)測
        3.4.5 HalI/R蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測
        3.4.6 HalI/R蛋白的三維構(gòu)象模型
        3.4.7 蛋白質(zhì)交互作用研究
        3.4.8 halI/R基因密碼子偏向性分析
    3.5 小結(jié)
第四章 蜂房哈夫尼亞菌群體感應(yīng)基因halI/R的密碼子優(yōu)化與表達(dá)模型構(gòu)建
    4.1 前言
    4.2 材料與儀器
        4.2.1 實(shí)驗(yàn)菌株與質(zhì)粒
        4.2.2 引物
        4.2.3 主要試劑
        4.2.4 主要儀器
    4.3 實(shí)驗(yàn)方法
        4.3.1 halI/R基因密碼子的優(yōu)化與分析
        4.3.2 表達(dá)載體的構(gòu)建
        4.3.3 陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌E.coli BL21(DE3)
        4.3.4 陽性菌落pET22-halI-BL21、pET28-halR-BL21 的篩選
        4.3.5 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)
        4.3.6 重組蛋白表達(dá)情況的分析
    4.4 結(jié)果與討論
        4.4.1 halI/R基因密碼子的優(yōu)化與分析
        4.4.2 插入片段的獲取
        4.4.3 表達(dá)質(zhì)粒的線性化
        4.4.4 陽性克隆子的篩選與鑒定
        4.4.5 陽性轉(zhuǎn)化子E.coli BL21(DE3)的篩選
        4.4.6 目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)
        4.4.7 表達(dá)情況分析及Western Blotting鑒定
    4.5 小結(jié)
第五章 蜂房哈夫尼亞菌HalI/R功能的初步研究
    5.1 前言
    5.2 材料與儀器
        5.2.1 實(shí)驗(yàn)菌株及培養(yǎng)條件
        5.2.2 材料準(zhǔn)備
        5.2.3 主要試劑
        5.2.4 主要儀器
    5.3 實(shí)驗(yàn)方法
        5.3.1 生物感應(yīng)器菌株檢測HalI蛋白合成AHL信號分子的能力
        5.3.2 GC-MS分析HalI蛋白所產(chǎn)信號分子的種類
        5.3.3 GC-MS分析HalR蛋白結(jié)合信號分子的能力
        5.3.4 分子對接分析HalR蛋白結(jié)合信號分子的作用機(jī)理
        5.3.5 HalI蛋白合成產(chǎn)物對蜂房哈夫尼亞菌生物膜的影響
    5.4 結(jié)果與討論
        5.4.1 HalI蛋白合成AHL信號分子的能力
        5.4.2 HalI蛋白合成信號分子的種類
        5.4.3 HalR蛋白結(jié)合信號分子的能力分析
        5.4.4 HalI蛋白合成產(chǎn)物對蜂房哈夫尼亞菌生物膜的影響
    5.5 小結(jié)
第六章 總結(jié)、創(chuàng)新點(diǎn)及展望
    6.1 總結(jié)
    6.2 創(chuàng)新點(diǎn)
    6.3 展望
參考文獻(xiàn)
碩士期間發(fā)表論文情況
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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[6]細(xì)菌群體感應(yīng)LuxR solos蛋白研究進(jìn)展[J]. 葉曉鋒,朱軍莉,汪海峰.  微生物學(xué)報. 2017(03)
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[8]信號分子N-�；呓z氨酸內(nèi)酯分析方法研究進(jìn)展[J]. 生弘杰,宋洋,卞永榮,柳廣霞,劉總堂,蔣新,王芳.  土壤學(xué)報. 2016(04)
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博士論文
[1]冷藏凡納濱對蝦特定腐敗菌群體感應(yīng)現(xiàn)象與致腐能力的研究[D]. 朱素芹.中國海洋大學(xué) 2015

碩士論文
[1]大黃魚特定腐敗菌S. baltica信號分子與生物胺消長關(guān)系及調(diào)控[D]. 馮杰.浙江工商大學(xué) 2018
[2]大黃魚腐敗希瓦氏菌群體感應(yīng)信號分子AHLs對其致腐性的影響及機(jī)制研究[D]. 張笑笑.浙江工商大學(xué) 2017
[3]凡納濱對蝦特定腐敗菌中AHLs介導(dǎo)的群體感應(yīng)與調(diào)控的初步研究[D]. 郭紅.中國海洋大學(xué) 2010



本文編號：3230483