粘質(zhì)沙雷氏菌脂肪酶作為一種重要的生物催化劑,已被廣泛應(yīng)用于催化水解、酯化等多種反應(yīng)。它能高立體選擇性水解拆分消旋體反式3-（4-甲氧苯基）縮水甘油酸甲酯（MPGM）制備（2R,3S）-（-）-3-（4-甲氧苯基）縮水甘油酸甲酯,即（-）-MPGM,后者是制備冠動脈血管舒張劑地爾硫卓的重要原料。本文對本研究所保藏的粘質(zhì)沙雷氏菌（Seratiamarcescens）H30所產(chǎn)的脂肪酶進(jìn)行了基因克隆、大腸桿菌重組表達(dá)、發(fā)酵優(yōu)化和固定化,并利用獲得的脂肪酶對手性醇進(jìn)行拆分研究。利用PCR方法克隆了粘質(zhì)沙雷氏菌H30的脂肪酶基因,并成功構(gòu)建了pET28a-lipase、pET32a-lipase和pGEX-4T-1-lipase三種重組表達(dá)載體,用大腸桿菌BL21（DE3）作為宿主菌株進(jìn)行表達(dá),篩選出酶活力最高的重組菌株pET32a-lipase,在搖瓶中進(jìn)行了脂肪酶可溶表達(dá)優(yōu)化,優(yōu)化后重組脂肪酶的最高酶活力為25000U/L。用凝血酶切除pET32a的N端Trx-tag后,所獲得的最高酶活力為65000U/L。用乳糖代替IPTG作為誘導(dǎo)劑,對重組菌株表達(dá)目的蛋白進(jìn)行了培養(yǎng)基組分和發(fā)酵條件的優(yōu)化... 

【文章來源】：華東理工大學(xué)上海市 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：81 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖１．６氨基載體固定化酶原理??Ｆｉｇ．?１．６?Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ?ｏｆ?ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｐｒｏｔｅｉｎｓ?ｏｎ?ａｍｉｎａｔｅｄ?ｓｕｐｐｏｒｔｓ??

表達(dá)質(zhì)粒pETZ翻.圖譜

圖２．３質(zhì)粒ｐ（；Ｆ．Ｘ－４Ｔ－ｌ圖譜??Ｆｉｇ．?２．３?Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?ｐｌａｓｍｉｄ?ｐＧＥＸ－４Ｔ－ｌ??將測序正確的艱組表達(dá)載體ｐＥＴ２８ａ－／／）；＞ａｓｅ、ｐＥＴ３２ａ－／／＞ｏｓｅ和ｐＧＥＸ－４Ｔ－１?轉(zhuǎn)化??ｃｏ／／．?ＢＬ２１?（ＤＥ３）感受態(tài)細(xì)胞，３７°Ｃ培養(yǎng)挑収生長較好的單菌落，接種予：３０ｍＬ含??抗十．素的ＬＢ液體培養(yǎng)基屮，３７°Ｃ振蕩培養(yǎng)過夜，収過夜培養(yǎng)的菌液ｌｍＬ，接種個：１００ｍＬ??Ｉｔ走沾抗十：襲的ＬＢ液休培養(yǎng)堆中，３７°Ｃ＇、ＳＯＯｒｐｍ＾Ｋ：寧：ＯＤ位為０．６－０．８Ａ：“，加入??０．１％?（ｖ／ｖ）?１Ｍ的誘異劑ＩＰＴＧ」］０°Ｃ培養(yǎng)８ｈ后離心收災(zāi)蘭體。將闡體取姑ｊ？２５ｍｌ?２５ｍＭ??Ｔｉ－ｉｓ－ｉｉａ（ｐｉｉ?８．〇）緩沖液中，超Ａ波破碎Ｉ則似適離心，對丨：仍ｙ沉淀??ＳＤＳ－ＰＡＧＥ?分桁。??２．３．１０?ＳＤＳ－ＰＡＧＥ檢測丨丨的蛋ｆｔ??凝膠Ｆｉｔ！制：分離膠、濃縮膠的配制／／法見表２．５．??

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]基因工程菌的高密度發(fā)酵研究[J]. 尹淑琴,范艷,常泓.  安徽農(nóng)業(yè)科學(xué). 2007(11)



本文編號：3227045