建立一種高效安全的基因定點編輯體系,為研究植物的光合作用途徑以及生理代謝過程提供理想材料。針對擬南芥靶基因ALB3設(shè)計2個sgRNA,引導(dǎo)Cas9蛋白識別PAM位點,從而實現(xiàn)ALB3基因的大片段敲除;將熒光篩選標(biāo)記基因mCherry組裝到CRISPR/Cas9載體中,構(gòu)建一種帶有熒光篩選標(biāo)記的CRISPR/Cas9載體;利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化擬南芥,對其后代進(jìn)行篩選驗證,在倒置熒光顯微鏡下挑選便可獲得Cas9-Free的純合突變種子。測序結(jié)果表明,含有可視化篩選標(biāo)記基因的擬南芥ALB3基因編輯載體序列與預(yù)期一致,由此證明載體構(gòu)建成功;通過倒置熒光顯微鏡觀察,發(fā)現(xiàn)陽性轉(zhuǎn)化擬南芥T₀種子含有紅色熒光標(biāo)記,表觀觀測以及分子鑒定表明T₁植株得到純合突變后代,條帶大小小于野生型,白化突變性狀明顯。挑選T₁不含熒光的種子進(jìn)行培育得到的T₂植株,經(jīng)分子鑒定發(fā)現(xiàn)已成功實現(xiàn)Cas9-Free且植株白化。本研究成功構(gòu)建了一種帶有熒光篩選標(biāo)記且可實現(xiàn)擬南芥ALB3基因敲除的CRISPR/Cas9載體,并獲得Cas9-Fre... 

【文章來源】：華北農(nóng)學(xué)報. 2020,35(01)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：7 頁

【部分圖文】：

pHDE-mCherry-ALB3表達(dá)載體的構(gòu)建

序列比對結(jié)果

重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3103感受態(tài)細(xì)胞后,為了驗證是否成功轉(zhuǎn)化,對其菌液進(jìn)行PCR鑒定,鑒定結(jié)果(圖3)顯示條帶大小在500～750 bp,符合預(yù)期大小,說明工程菌轉(zhuǎn)化成功。2.3 轉(zhuǎn)化后代的可視化篩選

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]利用CRISPR/Cas9技術(shù)編輯Badh2基因改良粳稻香味[J]. 孫慧宇,宋佳,王敬國,劉化龍,孫健,莫天宇,徐善斌,鄭洪亮,鄒德堂.  華北農(nóng)學(xué)報. 2019(04)
[2]An effective strategy to establish a male sterility mutant mini-library by CRISPR/Cas9-mediated knockout of anther-specific genes in rice[J]. Kun Ma,Jingluan Han,Yu Hao,Zhongfang Yang,Junyu Chen,Yao-Guang Liu,Qinlong Zhu,Letian Chen.  Journal of Genetics and Genomics. 2019(05)
[3]Reduction in cadmium accumulation in japonica rice grains by CRISPR/Cas9-mediated editing of OsNRAMP5[J]. YANG Chang-hong,ZHANG Yang,HUANG Chao-feng.  Journal of Integrative Agriculture. 2019(03)
[4]利用CRISPR/Cas9技術(shù)創(chuàng)制大豆高油酸突變系[J]. 侯智紅,吳艷,程群,董利東,蘆思佳,南海洋,甘卓然,劉寶輝.  作物學(xué)報. 2019(06)
[5]CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)在基因功能和作物育種中的研究進(jìn)展[J]. 趙山山,邸一桓,郝光飛.  分子植物育種. 2019(21)
[6]CRISPR-Cas9系統(tǒng)敲除亞麻FAD2基因表達(dá)載體的構(gòu)建[J]. 張喻,江海霞,閆文亮,郭棟良,楊亮杰,葉佳麗,王玥,謝麗瓊.  分子植物育種. 2019(07)
[7]甘藍(lán)型油菜和甘藍(lán)CRISPR/Cas9編輯效果的快速檢測[J]. 孫勤富,劉東曉,林俐,吳德偉,吳健,王幼平.  中國油料作物學(xué)報. 2018(06)
[8]利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)培育抗褐條病木薯[J]. 謝龍蓮.  世界熱帶農(nóng)業(yè)信息. 2018(11)
[9]巨桉miR156 CRISPR/Cas9載體構(gòu)建[J]. 歐陽樂軍,袁玉梅,李莉梅,陳剴釗,戴發(fā).  森林與環(huán)境學(xué)報. 2018(04)



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