發(fā)布時間：2021-06-05 06:40

　　α-淀粉酶又稱淀粉-1,4-糊精酶,也命名為α-1,4-D-葡聚糖-葡萄糖苷水解酶,其作用于淀粉時,可以從淀粉、多聚糖或寡聚糖分子內(nèi)部隨機地切開α-1,4-葡萄糖苷鍵,產(chǎn)生葡萄糖、麥芽糖和低聚糖等。α-淀粉酶在食品、藥品、紡織、造紙等工業(yè)領(lǐng)域廣泛應用。超高溫α-淀粉酶是指最適溫度在90℃以上的α-淀粉酶,它具有更優(yōu)越的的酶學特性,使得它更適用于淀粉的噴射液化工藝,提高淀粉加工生產(chǎn)效率,降低生產(chǎn)成本。枯草芽孢桿菌是一類革蘭氏陽性桿狀好氧型細菌,也是芽孢桿菌中的模式生物,被美國食品藥物管理局（FDA）和中國農(nóng)業(yè)部等部門批準為食品安全微生物（GRAS）。因此,利用枯草芽孢桿菌表達系統(tǒng)來生產(chǎn)酶制劑在工業(yè)上具有很大的價值。實驗室前期對枯草芽孢桿菌表達系統(tǒng)有一定研究和改造,現(xiàn)擁有良好的枯草芽孢桿菌表達宿主。本研究將來源于極端嗜熱古菌Pyrococcus furiosus的超高溫α-淀粉酶（PFA）基因在Bacillus subtilis中表達,并測定重組超高溫α-淀粉酶的酶學性質(zhì)。通過信號肽篩選、伴侶蛋白共表達和熱處理等方式,有效提高PFA在枯草芽孢桿菌中重組表達的胞外酶活。最后在在搖瓶基礎(chǔ)上,對... 

【文章來源】：江南大學江蘇省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：71 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

重組質(zhì)粒pHY300PLK-pfa的構(gòu)建Fig.3-1ConstructionofrecombinantplasmidpHY300PLK-pfa根據(jù)In-FusionHDCloningKit試劑盒要求，將基因片段與載體片段按照摩爾比

江南大學碩士學位論文24圖3-2重組質(zhì)粒pHY300PLK-pfa的HindIII酶切驗證;M：10000bp標準核酸分子量；1：質(zhì)粒酶切樣品Fig.3-2HindIIIdigestionofrecombinantplasmidpHY300PLK-pfaM:10000bpMaker;1:plasmiddigestedsample利用枯草芽孢桿菌化學轉(zhuǎn)化方法，將重組質(zhì)粒pHY300PLK-pfa轉(zhuǎn)化到感受態(tài)宿主菌B.subtilisWS9中，然后涂布到四環(huán)素抗性(20μg·mL-1)的液體固體LB培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)10h。挑陽性單克隆到液體LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)10h后按照2.5%的接種量轉(zhuǎn)接到TB培養(yǎng)基中，相同條件繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)60h。發(fā)酵結(jié)束后離心取上清，并用去離子水稀釋OD600為5的菌體，隨后在超聲破碎儀中進行破碎，離心取破壁上清。測定胞外胞內(nèi)酶活，其中胞外酶活為18.33U·mL-1，胞內(nèi)酶活為11.9U·mL-1。3.1.2重組超高溫α-淀粉酶酶學性質(zhì)為了更全面地了解來源于嗜熱古菌P.furiosus在枯草芽孢桿菌中表達的重組超高溫α-淀粉酶的相關(guān)特征，對該酶的酶學性質(zhì)進行了初步探究，探究了重組酶的最適溫度、溫度穩(wěn)定性、最適pH、pH穩(wěn)定性等相關(guān)信息，為其在應用方面提供參考。3.1.2.1重組超高溫α-淀粉酶最適溫度為了測定重組超高溫α-淀粉酶的最適溫度，要控制其它條件不變。實驗選擇pH為5.0的檸檬酸緩沖液，在不同的溫度條件下(40～100℃)測定重組超高溫α-淀粉酶的酶活。以最高酶活為100%，計算不同溫度下的相對酶活。測定結(jié)果如圖3-3。由圖可知重組酶的最適溫度為100℃，隨著溫度的降低酶活持續(xù)降低，70℃時該重組酶只有53.39%的相對酶活，到40℃時該重組酶僅有7.1%的酶活力。

江南大學碩士學位論文28圖3-7信號肽篩選質(zhì)粒pBES-sp-pfa的構(gòu)建Fig.3-7ConstructionofsignalpeptidescreeningplasmidpBES-sp-pfa目的基因與篩選載體構(gòu)建的重組篩選質(zhì)粒，采用NdeI和EcoRI雙酶切驗證，酶切結(jié)果如圖3-8。圖3-8重組質(zhì)粒pBES-pfa雙酶切驗證。M：10000bp標準核酸分子量；1：質(zhì)粒酶切樣品Fig.3-8RecombinantplasmidpBES-pfadoublerestrictiondigestionverification.M:10000bpMaker;1:plasmiddigestedsample經(jīng)酶切驗證和測序正確后，替換篩選載體上的信號肽，構(gòu)建信號肽篩選文庫。以重組篩選載體為模板，PCR擴增不含信號肽的載體片段，膠回收后與枯草芽孢桿菌173種混合的SPDNAmixture進行隨機無縫鏈接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliJM109，涂布于含有氨芐抗性(100μg·mL-1)的LB平板固體培養(yǎng)基中37℃過夜培養(yǎng)，隨機挑取3-5個單克隆于LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，次日收集菌體進行測序，驗證質(zhì)粒文庫構(gòu)建是否正確。測序結(jié)果顯示這幾個單克隆信號肽存在差異，說明構(gòu)建的質(zhì)粒文庫合理可用。如表3.3，

【參考文獻】：
期刊論文
[1]極端嗜熱酸性α-淀粉酶PFA在枯草芽孢桿菌中的高效分泌表達[J]. 袁林,曾靜,郭建軍,郭浩,楊罡,陳俊.  食品科學. 2018(18)
[2]介導新生肽鏈折疊的胞質(zhì)分子伴侶結(jié)構(gòu)、功能及作用機制研究進展[J]. 于志超,李艷妮,喬建軍.  生物物理學報. 2014(03)
[3]枯草芽孢桿菌作為外源基因表達系統(tǒng)的研究進展[J]. 沈衛(wèi)鋒,牛寶龍,翁宏飚,何麗華,孟智啟.  浙江農(nóng)業(yè)學報. 2005(04)
[4]合成耐高溫α-淀粉酶基因在巴斯德畢赤酵母中的分泌表達[J]. 韋宇拓,汪嶸,杜麗琴,陸堅,黃鯤,黃日波.  中國生物工程雜志. 2005(01)
[5]枯草芽孢桿菌整合載體研究進展[J]. 鄒立扣,王紅寧,潘欣.  生物技術(shù)通訊. 2003(06)
[6]耐高溫α-淀粉酶在酒精生產(chǎn)中的應用[J]. 馬福強.  釀酒科技. 2001(03)
[7]分子伴侶蛋白結(jié)構(gòu)與功能的研究進展[J]. 朱美財,劉成剛.  空軍總醫(yī)院學報. 1999(04)
[8]五種α─淀粉酶測活方法的比較研究[J]. 史永昶,姜涌明.  微生物學通報. 1996(06)
[9]α－淀粉酶的生產(chǎn)與應用[J]. 谷軍.  生物技術(shù). 1994(03)

博士論文
[1]枯草芽孢桿菌菌株改造、啟動子優(yōu)化和普魯蘭酶的高效制備研究[D]. 張康.江南大學 2018
[2]來源于極端嗜熱古菌Pyrococcus furiosus分子伴侶蛋白功能及其應用性研究[D]. 彭帥英.華東理工大學 2017
[3]枯草芽孢桿菌中Sec分泌途徑底物特性及非經(jīng)典分泌途徑的研究[D]. 王光強.江南大學 2013
[4]Pyrococcus furiosus a-淀粉酶基因在不同宿主中的表達[D]. 沈微.江南大學 2003

碩士論文
[1]來源于Pyrococcus furiosus極端嗜熱α-淀粉酶的研究[D]. 王麗薩.中國科學院研究生院（上海生命科學研究院） 2007



本文編號：3211647