α-淀粉酶又稱淀粉-1,4-糊精酶,也命名為α-1,4-D-葡聚糖-葡萄糖苷水解酶,其作用于淀粉時(shí),可以從淀粉、多聚糖或寡聚糖分子內(nèi)部隨機(jī)地切開α-1,4-葡萄糖苷鍵,產(chǎn)生葡萄糖、麥芽糖和低聚糖等。α-淀粉酶在食品、藥品、紡織、造紙等工業(yè)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。超高溫α-淀粉酶是指最適溫度在90℃以上的α-淀粉酶,它具有更優(yōu)越的的酶學(xué)特性,使得它更適用于淀粉的噴射液化工藝,提高淀粉加工生產(chǎn)效率,降低生產(chǎn)成本�？莶菅挎邨U菌是一類革蘭氏陽性桿狀好氧型細(xì)菌,也是芽孢桿菌中的模式生物,被美國(guó)食品藥物管理局（FDA）和中國(guó)農(nóng)業(yè)部等部門批準(zhǔn)為食品安全微生物（GRAS）。因此,利用枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)來生產(chǎn)酶制劑在工業(yè)上具有很大的價(jià)值。實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)有一定研究和改造,現(xiàn)擁有良好的枯草芽孢桿菌表達(dá)宿主。本研究將來源于極端嗜熱古菌Pyrococcus furiosus的超高溫α-淀粉酶（PFA）基因在Bacillus subtilis中表達(dá),并測(cè)定重組超高溫α-淀粉酶的酶學(xué)性質(zhì)。通過信號(hào)肽篩選、伴侶蛋白共表達(dá)和熱處理等方式,有效提高PFA在枯草芽孢桿菌中重組表達(dá)的胞外酶活。最后在在搖瓶基礎(chǔ)上,對(duì)... 

【文章來源】：江南大學(xué)江蘇省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：71 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

重組質(zhì)粒pHY300PLK-pfa的構(gòu)建Fig.3-1ConstructionofrecombinantplasmidpHY300PLK-pfa根據(jù)In-FusionHDCloningKit試劑盒要求，將基因片段與載體片段按照摩爾比

江南大學(xué)碩士學(xué)位論文24圖3-2重組質(zhì)粒pHY300PLK-pfa的HindIII酶切驗(yàn)證;M：10000bp標(biāo)準(zhǔn)核酸分子量；1：質(zhì)粒酶切樣品Fig.3-2HindIIIdigestionofrecombinantplasmidpHY300PLK-pfaM:10000bpMaker;1:plasmiddigestedsample利用枯草芽孢桿菌化學(xué)轉(zhuǎn)化方法，將重組質(zhì)粒pHY300PLK-pfa轉(zhuǎn)化到感受態(tài)宿主菌B.subtilisWS9中，然后涂布到四環(huán)素抗性(20μg·mL-1)的液體固體LB培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)10h。挑陽性單克隆到液體LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)10h后按照2.5%的接種量轉(zhuǎn)接到TB培養(yǎng)基中，相同條件繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)60h。發(fā)酵結(jié)束后離心取上清，并用去離子水稀釋OD600為5的菌體，隨后在超聲破碎儀中進(jìn)行破碎，離心取破壁上清。測(cè)定胞外胞內(nèi)酶活，其中胞外酶活為18.33U·mL-1，胞內(nèi)酶活為11.9U·mL-1。3.1.2重組超高溫α-淀粉酶酶學(xué)性質(zhì)為了更全面地了解來源于嗜熱古菌P.furiosus在枯草芽孢桿菌中表達(dá)的重組超高溫α-淀粉酶的相關(guān)特征，對(duì)該酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了初步探究，探究了重組酶的最適溫度、溫度穩(wěn)定性、最適pH、pH穩(wěn)定性等相關(guān)信息，為其在應(yīng)用方面提供參考。3.1.2.1重組超高溫α-淀粉酶最適溫度為了測(cè)定重組超高溫α-淀粉酶的最適溫度，要控制其它條件不變。實(shí)驗(yàn)選擇pH為5.0的檸檬酸緩沖液，在不同的溫度條件下(40～100℃)測(cè)定重組超高溫α-淀粉酶的酶活。以最高酶活為100%，計(jì)算不同溫度下的相對(duì)酶活。測(cè)定結(jié)果如圖3-3。由圖可知重組酶的最適溫度為100℃，隨著溫度的降低酶活持續(xù)降低，70℃時(shí)該重組酶只有53.39%的相對(duì)酶活，到40℃時(shí)該重組酶僅有7.1%的酶活力。

江南大學(xué)碩士學(xué)位論文28圖3-7信號(hào)肽篩選質(zhì)粒pBES-sp-pfa的構(gòu)建Fig.3-7ConstructionofsignalpeptidescreeningplasmidpBES-sp-pfa目的基因與篩選載體構(gòu)建的重組篩選質(zhì)粒，采用NdeI和EcoRI雙酶切驗(yàn)證，酶切結(jié)果如圖3-8。圖3-8重組質(zhì)粒pBES-pfa雙酶切驗(yàn)證。M：10000bp標(biāo)準(zhǔn)核酸分子量；1：質(zhì)粒酶切樣品Fig.3-8RecombinantplasmidpBES-pfadoublerestrictiondigestionverification.M:10000bpMaker;1:plasmiddigestedsample經(jīng)酶切驗(yàn)證和測(cè)序正確后，替換篩選載體上的信號(hào)肽，構(gòu)建信號(hào)肽篩選文庫(kù)。以重組篩選載體為模板，PCR擴(kuò)增不含信號(hào)肽的載體片段，膠回收后與枯草芽孢桿菌173種混合的SPDNAmixture進(jìn)行隨機(jī)無縫鏈接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliJM109，涂布于含有氨芐抗性(100μg·mL-1)的LB平板固體培養(yǎng)基中37℃過夜培養(yǎng)，隨機(jī)挑取3-5個(gè)單克隆于LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，次日收集菌體進(jìn)行測(cè)序，驗(yàn)證質(zhì)粒文庫(kù)構(gòu)建是否正確。測(cè)序結(jié)果顯示這幾個(gè)單克隆信號(hào)肽存在差異，說明構(gòu)建的質(zhì)粒文庫(kù)合理可用。如表3.3，

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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博士論文
[1]枯草芽孢桿菌菌株改造、啟動(dòng)子優(yōu)化和普魯蘭酶的高效制備研究[D]. 張康.江南大學(xué) 2018
[2]來源于極端嗜熱古菌Pyrococcus furiosus分子伴侶蛋白功能及其應(yīng)用性研究[D]. 彭帥英.華東理工大學(xué) 2017
[3]枯草芽孢桿菌中Sec分泌途徑底物特性及非經(jīng)典分泌途徑的研究[D]. 王光強(qiáng).江南大學(xué) 2013
[4]Pyrococcus furiosus a-淀粉酶基因在不同宿主中的表達(dá)[D]. 沈微.江南大學(xué) 2003

碩士論文
[1]來源于Pyrococcus furiosus極端嗜熱α-淀粉酶的研究[D]. 王麗薩.中國(guó)科學(xué)院研究生院（上海生命科學(xué)研究院） 2007



本文編號(hào)：3211647