PGC7又稱Dppa3或Stella,是一個在早期胚胎發(fā)育過程中維持印記的母源效應(yīng)因子,還是一個能通過調(diào)節(jié)印記基因表達促進細胞多能性維持及重編程過程發(fā)生的小蛋白。該蛋白在小鼠中只有150個氨基酸而且是一個非折疊結(jié)構(gòu)的蛋白,能與多種具有功能的蛋白質(zhì)結(jié)合來發(fā)揮功能。HDAC1/2-RBBP4/7復(fù)合物由去乙酰化酶HDAC1/2和組蛋白伴侶RBBP4/7組成,該復(fù)合物能與其他蛋白結(jié)合組成更大的蛋白復(fù)合物發(fā)揮功能。Dlk1-Dio3印記區(qū)是研究哺乳動物印記調(diào)控的理想模型,且參與干細胞水平以及多種疾病發(fā)病機理的細胞生物學(xué)過程,甚至該區(qū)域長非編碼RNA是否正確表達可以判定誘導(dǎo)多能干細胞的全分化潛能。本研究分析PGC7蛋白質(zhì)譜數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)RBBP4為潛在的PGC7相互作用蛋白,首先確定了兩者的互作及細胞內(nèi)定位并通過ChIP-qPCR檢測兩者在Dlk1-Dio3基因簇主要甲基化調(diào)控區(qū)域IG-DMR的結(jié)合情況。進一步構(gòu)建了穩(wěn)定敲降RBBP4的小鼠F9細胞系,通過實時熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)RBBP4敲降后會導(dǎo)致印記基因Dlk1、Meg3、Peg10和Rasgrf的mRNA水平表達顯著下降。亞硫酸氫鹽DNA甲基化測... 

【文章來源】：西北農(nóng)林科技大學(xué)陜西省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：88 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 文獻綜述
    1.1 PGC7蛋白研究進展
        1.1.1 PGC7的基本生物特性
        1.1.2 PGC7保護母源基因組和印記位點
        1.1.3 PGC7促進細胞多能性維持
        1.1.4 PGC7促進體細胞重編程
    1.2 Dlk1-Dio3印記調(diào)控區(qū)
    1.3 印記調(diào)控與細胞多能性
    1.4 RBBP4蛋白研究進展
    1.5 HDAC1/2-RBBP4/7蛋白復(fù)合物
    1.6 組蛋白去乙�；cDNA甲基化
第二章 RBBP4與PGC7互作驗證及共定位分析
    2.1 材料與方法
        2.1.1 材料
        2.1.2 主要儀器、試劑及溶液配制
        2.1.3 方法
    2.2 試驗結(jié)果
        2.2.1 目的片段擴增結(jié)果
        2.2.2 PGC7與RBBP4互作驗證結(jié)果
        2.2.4 PGC7與RBBP4蛋白共定位分析
    2.3 討論
    2.4 小結(jié)
第三章 PGC7與RBBP4對Dlk1-Dio3印記區(qū)的調(diào)控
    3.1 材料與試劑
        3.1.1 材料
        3.1.2 主要儀器、試劑及溶液配制
    3.2 試驗方法
        3.2.1 染色質(zhì)免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,Ch IP)
        3.2.2 RBBP4穩(wěn)定敲降小鼠F9細胞系獲得
        3.2.3 實時定量PCR(quantitative real-time PCR)
        3.2.4 DNA甲基化檢測(亞硫酸氫鹽修飾后測序法)
        3.2.5 堿性磷酸酶染色(Alkaline Phosphatase,AP染色)
        3.2.6 CCK細胞增殖實驗
    3.3 試驗結(jié)果
        3.3.1 PGC7與RBBP4蛋白在Dlk1-Dio3印記區(qū)IG-DMR結(jié)合驗證
        3.3.2 RBBP4單等位基因敲除小鼠F9 細胞系鑒定
        3.3.3 RBBP4敲降對印記基因表達影響
        3.3.4 RBBP4敲降對Dlk1-DMR和Meg3-DMR甲基化影響
        3.3.5 RBBP4敲降對整體DNA甲基化水平影響
        3.3.6 RBBP4敲降對組蛋白H4乙�；绊�
        3.3.7 RBBP4對細胞多能性的影響
        3.3.8 RBBP4與PGC7對細胞增殖的影響
    3.4 討論
    3.5 小結(jié)
第四章 PGC7對HDAC1/2-RBBP4/7復(fù)合物互作影響
    4.1 材料與方法
        4.1.1 材料
        4.1.2 主要儀器、試劑及溶液配制
        4.1.3 方法
    4.2 試驗結(jié)果
        4.2.1 Hdac1、Hdac2、Rbbp7 基因PCR擴增
        4.2.2 Hdac1、Hdac2、Rbbp7 真核表達載體雙酶切驗證
        4.2.3 PGC7分別與HDAC1、HDAC2、RBBP7互作驗證
        4.2.4 PGC7加入對HDAC1/2-RBBP4/7復(fù)合物自身相互作用的影響
    4.3 討論
    4.4 小結(jié)
第五章 PGC7與HDAC1對Dlk1-Dio3印記區(qū)的調(diào)控
    5.1 材料與方法
        5.1.1 材料
        5.1.2 主要儀器、試劑及溶液配制
        5.1.3 方法
    5.2 結(jié)果
        5.2.1 PGC7與HDAC1在小鼠F9 細胞中的定位
        5.2.2 HDAC1在Dlk1-Dio3印記調(diào)控區(qū)IG-DMR結(jié)合情況
        5.2.3 PGC7干擾對HDAC1在Dlk1-Dio3調(diào)控區(qū)IG-DMR結(jié)合影響
        5.2.4 PGC7和HDAC1對Dlk1、Meg3表達影響
    5.3 討論
    5.4 小結(jié)
全文總結(jié)
參考文獻
附錄A 引物序列
附錄B 真核表達質(zhì)粒載體骨架圖譜
致謝
作者簡介



本文編號：3205317