本研究構(gòu)建了分泌表達(dá)唾液酸酶的重組枯草芽孢桿菌WB800N-pHT43-sia,優(yōu)化了產(chǎn)酶條件,在TB培養(yǎng)基中,添加1 mM的誘導(dǎo)劑,30℃下誘導(dǎo)18 h后酶活最高,達(dá)到401 U/mL,比優(yōu)化前酶活（192.8 U/mL）提高了2.1倍。利用生長(zhǎng)細(xì)胞體系轉(zhuǎn)化多唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂（GLS）生產(chǎn)單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂（GM1）,10g/L的GLS在優(yōu)化產(chǎn)酶后的生長(zhǎng)細(xì)胞體系中轉(zhuǎn)化2d后,GLS全部轉(zhuǎn)化成GM1,GM1的濃度從初始的0.12 mg/mL增加到2.23 mg/mL,比優(yōu)化前體系中GM1濃度提高了兩倍多。研究了重組唾液酸酶的酶學(xué)性質(zhì),最適溫度為37℃,最適pH為6.5,在pH 5.5-7.0的范圍內(nèi)酶活較穩(wěn)定。唾液酸酶的Km值為0.15 mmol/L,Vmax為0.69μmol/min。唾液酸對(duì)唾液酸酶的抑制類型為競(jìng)爭(zhēng)性抑制,抑制常數(shù)為0.15 mmol/L。將透析（一種在位分離技術(shù)）應(yīng)用到游離酶催化GLS生產(chǎn)GM1的體系中,解除了唾液酸對(duì)唾液酸酶的抑制作用。50 g/L GLS,10000 U/mL酶量,12 h后GLS全部轉(zhuǎn)化為GM1,GM1的含量從0.42 mg/mL增加到了10... 

【文章來(lái)源】：華東理工大學(xué)上海市 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁(yè)數(shù)】：76 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

圖１．２細(xì)菌唾液酸酶結(jié)構(gòu)圖??Ｆｉｇ．?１．２?Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｏｆ?ｂａｃｔｅｒｉａｌ?ｓｉａｌｉｄａｓｅｓ??

芽孢桿菌ＷＢ８００Ｎ菌株和質(zhì)粒ｐＨＴ４３為華東理工大學(xué)魯華生物技術(shù)研究所魏巍老師課??題組饋贈(zèng)。ｐＨＴ４３質(zhì)粒在本課題中用于構(gòu)建枯草芽孢桿菌表達(dá)體系。ｃｏ／／??ＤＨ５ａ用于基因的克隆，ｐＨＴ４３質(zhì)粒的質(zhì)粒圖譜和克隆表達(dá)區(qū)域見(jiàn)圖２．１。??（ａ）??Ｘｈｏｌ??Ｃｆａ?Ｉ?？??＼?ｉ?一?Ｉ??ＳｅｘＡｉ??、?〇ＲＦ－２??ＡｍｐＲ＾ｌ??＾?ＯＲＦ－１?％??ＣｏｌＥ１?Ｂ??，?ｐＨＴ４３?等??Ｔ—Ａ＾ｌｌ??＼?８０５７?ｂｐ?１??％＾〇ＲＦ－３?ＣｍＲ?？；??Ａ??／?ｇｍｃ?、??／?＾Ｌａｃｌ?為Ｍｕｎ?１??ｓｍ；，?和?Ｓａｄ??＿?Ａｐａ＼??Ｘｂａ?Ｉ??Ｂａｍ?ｈｉ?Ｐｇｒａｃ：?Ｐｇｒａｃ?ｐｒｏｍｏｔｅｒ?（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ?ｏｆ?ｔｈｅ??ｇｒｏＥ．?ｐｒｏｍｏｔｅｒ；?ｔｈｅ?／ａｃＯｏｐｅｒａｔｏｒａｎｄ?ｔｈｅ??ｇｓＢＳＤ?ｓｅｑｕｅｎｃｅ）??ＣｏｌＥ?１?ｏｒｉ：?ＣｏｌＥ?１?ｏｒｉｇｉｎ??Ａｍｐ

調(diào)ｐＨ為７．５）?＝７０：?３０?（ｖ／ｖ）。高效液相色譜的檢測(cè)條件為２０５?ｎｍ，?１?ｍＬ／ｍｉｎ，２５°Ｃ，??進(jìn)樣量為２０?｜ｉＬ。??ＧＭ１的標(biāo)準(zhǔn)曲線如下圖２．２。??３００００?－１??２５０００?－?ｙ＝?５．４３３ｘ?＋?９０Ｊ２＾??Ｒ２＝?０．９９３０＾??２００００?－??Ｈ?１５０００?－??１００００?－??５０００?－??０??１?１?１?１?１?１??０?１０００?２０００?３０００?４０００?５０００?６０００??ＧＭ１?濃度（ｎｇ／ｍＬ）??圖２．２?標(biāo)準(zhǔn)曲線??Ｆｉｇ．２．２?Ｔｈｅ?ｓｔａｎｄａｒｄ?ｃｕｒｖｅ?ｏｆ?ＧＭ１??２．５實(shí)驗(yàn)結(jié)果??２．５．１唾液酸酶目的基因的擴(kuò)增??以本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的大腸桿菌重組菌株五．ｃｏ／／?ＢＬ２１（ＤＥ３）－ｐＥＴ－２８ａ－＾／中的目的??基因?yàn)槟０�，聚合酶鏈�(zhǔn)椒磻?yīng)ＰＣＲ進(jìn)行擴(kuò)增，由下圖２．３看到擴(kuò)增產(chǎn)物中有一條分??子大小約為３０００?ｂｐ的單一目的條帶，它與唾液酸酶基因片段大小相同并將擴(kuò)增出來(lái)的??ＤＮＡ送去公司測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與己知的唾液酸酶基因序列進(jìn)行比對(duì)，序列一致，說(shuō)明??成功的擴(kuò)增得到唾液酸酶基因。??

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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