發(fā)布時(shí)間：2021-01-06 09:27

　　高效特異的基因敲除技術(shù)對(duì)于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的制備,臨床生物治療的發(fā)展以及人類遺傳病的預(yù)防和治療具有重要意義。目前廣泛應(yīng)用的基因敲除技術(shù)包括ZFN,TALEN以及基于胚胎干細(xì)胞的DNA同源重組,這些技術(shù)均基于錯(cuò)配修復(fù)的原理,通過使用相關(guān)的核酸內(nèi)切酶切割DNA分子雙鏈,進(jìn)而實(shí)現(xiàn)基因的敲除。在實(shí)踐中,這些技術(shù)都存在明顯缺陷,繁瑣而效率低下,且會(huì)造成一定數(shù)目的堿基序列改變,所以對(duì)基因的編碼區(qū)和對(duì)基因表達(dá)有一定調(diào)節(jié)功能的內(nèi)含子均會(huì)產(chǎn)生一定的影響。最近幾年發(fā)展起來的CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)可以更為高效、快速地實(shí)現(xiàn)對(duì)特定基因序列的敲除,但其特異性較差,存在嚴(yán)重脫靶效應(yīng),且切割序列難以控制等缺點(diǎn)。因此開發(fā)具有高效率,高特異性并且可對(duì)DNA堿基序列改變可控的新基因敲除方法是促進(jìn)對(duì)基因功能研究,經(jīng)濟(jì)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制備及重大疾病的生物治療的現(xiàn)實(shí)所需,具有重要的理論意義和重要的臨床及經(jīng)濟(jì)價(jià)值。最近發(fā)展起來的基于CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的堿基轉(zhuǎn)換技術(shù)可以準(zhǔn)確地對(duì)引導(dǎo)RNA靶序列中某些單堿基進(jìn)行轉(zhuǎn)換,該技術(shù)可以在只有DNA分子單鏈斷裂的情況下實(shí)現(xiàn)堿基的轉(zhuǎn)換。利用該方法可以實(shí)現(xiàn)對(duì)目的基因更為精確、高效地定... 

【文章來源】：東北師范大學(xué)吉林省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：59 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

構(gòu)建小鼠基因敲除模型流程示意圖

圖 1.2 ZFN 結(jié)構(gòu)示意圖[9]至今為止，基于 ZFN 的基因打靶技術(shù)已經(jīng)在多種生物中得到運(yùn)用。2003 年成功利用 ZFN 技術(shù)使得果蠅發(fā)生突變，實(shí)現(xiàn)了動(dòng)物體的基因敲除[10]。隨后]，斑馬魚[12]，擬南芥[13]等模式生物中，ZFN 介導(dǎo)的基因打靶技術(shù)也成功得后的研究中，ZFN 技術(shù)成功地在各種植物和動(dòng)物中實(shí)現(xiàn)了基因的敲除。同早期的基因打靶技術(shù)而言，ZFN 技術(shù)的基因打靶效率有所提高，但該技術(shù)的缺點(diǎn)和局限。首先，目前對(duì)于 ZFN 和 DNA 靶序列的相互作用關(guān)系了解還

到宿主 DNA 并激活，進(jìn)而導(dǎo)致宿主患病[14]。這些 TAL 效應(yīng)物經(jīng)過細(xì)菌的 III 類統(tǒng)進(jìn)入到植物細(xì)胞中，通過調(diào)節(jié)基因啟動(dòng)子來調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)菌的生長(zhǎng)和由于 TAL 效應(yīng)物可以與特定序列特異性結(jié)合，于是同 ZFN 技術(shù)類似，研究人員核酸酶與一段人造 TAL 效應(yīng)物連接起來，創(chuàng)造出了具有特定基因編輯功能的強(qiáng) TALEN。TALEN 主要結(jié)構(gòu)一般由三部分組成，一個(gè)是 N 端結(jié)構(gòu)域，由核定為信號(hào) NLclear localization signal）組成；一個(gè)是中央結(jié)構(gòu)域，由 TALE 重復(fù)序列組成，該可特異性識(shí)別 DNA 序列；一個(gè)是 C 端結(jié)構(gòu)域，由 FokI 核酸酶組成。通常，TALE央結(jié)構(gòu)域是由一系列約 33-35 個(gè)氨基酸構(gòu)成的重復(fù)多肽，每一個(gè)結(jié)構(gòu)域都可以特別一對(duì)堿基。在這些氨基酸中，絕大多數(shù)氨基酸都是保守的，只有第 12 位和第 氨基酸是可變的。因此，這兩個(gè)氨基酸也稱之為重復(fù)可變的雙氨基酸殘基（repeble di-residue, RVD）。RVD 不同的序列排序可以識(shí)別不同的堿基，四種堿基 A、T 都具有其相應(yīng)的 RVD，分別是 NI、NG、HD 以及 NN，因此 RVD 控制了 TALE域特異性識(shí)別的堿基序列。在構(gòu)建人工 TALEN 核酸酶時(shí)，可以根據(jù) RVD 的規(guī)則識(shí)別不同序列的結(jié)構(gòu)域。


本文編號(hào)：2960328