里氏木霉（Trichoderma reesei）是生產(chǎn)纖維素酶的重要工業(yè)菌株,同時(shí)也可用于表達(dá)多種外源蛋白,但目前對(duì)其進(jìn)行基因組編輯的技術(shù)尚不成熟,表達(dá)嚴(yán)重依賴(lài)于CBH1表達(dá)系統(tǒng)。本論文對(duì)里氏木霉中的基因組編輯進(jìn)行了研究,并嘗試開(kāi)發(fā)了CBH1的補(bǔ)充表達(dá)系統(tǒng)。本研究取得了如下結(jié)果:1.CRISPR-Cas9技術(shù)在里氏木霉的初步建立本研究通過(guò)胞內(nèi)表達(dá)Cas9和體外裝載Cas9-gRNA兩種方法進(jìn)行基因敲除以及在此基礎(chǔ)上定點(diǎn)插入基因的方法。首先,在里氏木霉QM9414菌株胞內(nèi)表達(dá)Cas9,并轉(zhuǎn)化體外轉(zhuǎn)錄的gRNA,得到了5-FOA抗性的轉(zhuǎn)化子,ura5基因發(fā)生了脫靶的基因編輯現(xiàn)象,在靶位點(diǎn)下游70-和100-bp處插入/缺失9-或12-bp。其次,將胞外組裝的Cas9-gRNA和帶有pyr4標(biāo)記基因的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化到里氏木霉TU-6菌株,當(dāng)靶向主要的外切纖維素酶cbh1時(shí),發(fā)現(xiàn)在27個(gè)轉(zhuǎn)化子中有8個(gè)轉(zhuǎn)化子失去了表達(dá)CBH1的能力,這表明通過(guò)基因組編輯成功地敲除了cbh1基因。進(jìn)一步的序列分析表明,在靶位點(diǎn)處插入了共轉(zhuǎn)化質(zhì)粒、染色體基因,或兩者的混合物。此外,研究了定點(diǎn)插入基因的方法,在HDR介導(dǎo)... 

【文章來(lái)源】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京市

【文章頁(yè)數(shù)】：74 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

CRISPR-Cas9干擾外源DNA入侵的示意圖（方銳等，2013）

院碩士學(xué)位論文 制 RNA 聚合酶和上游啟動(dòng)子的結(jié)合，從而激活或抑制下游相對(duì)應(yīng)的基因的表達(dá)，以此為基礎(chǔ)構(gòu)建的生物傳感器，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于大腸桿木霉及哺乳動(dòng)物細(xì)胞等多種生物�；谵D(zhuǎn)錄因子的生物傳感器的結(jié)構(gòu)Wang et al., 2016)利用細(xì)菌的轉(zhuǎn)錄因子 XylR 和真核生物啟動(dòng)子，建立了/調(diào)節(jié)基因元件，系統(tǒng)地設(shè)計(jì)和驗(yàn)證了細(xì)菌的阻遏蛋白為基礎(chǔ)的木糖感應(yīng)母中建立了一種以細(xì)胞分選為基礎(chǔ)的，快速、有力的高通量篩選木糖轉(zhuǎn)糖轉(zhuǎn)運(yùn)子的突變體 HXT14，在木糖的轉(zhuǎn)運(yùn)能力上提高了 6.5 倍。(Ellis et al., 2012)利用枯草芽孢桿菌的轉(zhuǎn)錄抑制因子 FapR，建立了反應(yīng)lonyl-CoA）濃度的生物傳感器，阻遏蛋白 FapR 的表達(dá)會(huì)抑制與脂肪酸，而丙二酰輔酶 A 濃度的變化會(huì)調(diào)控下游報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄，通過(guò)熒光信Teo et al., 2015)利用三種不同的細(xì)菌來(lái)源的 XylR 阻遏蛋白和合成的啟了生物傳感器，通過(guò)木糖的濃度調(diào)節(jié)熒光報(bào)告基因的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果響 XylR 對(duì)報(bào)告基因阻遏的能力。此外，在工程酵母細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中表達(dá)量的增加。

圖 2.1 重組表達(dá)質(zhì)粒 pPdc1-cas9Fig. 2.1 Recombinant expression plasmid of pPdc1-cas9選對(duì) 12 個(gè) cas9 轉(zhuǎn)化子進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)增條帶為 200-bp，除去泳道 8 和 12 之外，剩余的 9 驗(yàn)。圖 2.2 PCR 鑒定里氏木霉轉(zhuǎn)化子中 cas9 基因M：DNA marker；泳道 1-12 為轉(zhuǎn)化子ration of the cas9 gene in T. reesei transformants by PCR. M: DNA

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]CRISPR/Cas9在絲狀真菌基因組編輯中的應(yīng)用[J]. 李紅花,劉鋼.  遺傳. 2017(05)
[2]ZFNs、TALENs和CRISPR-Cas基因組靶向編輯技術(shù)及其在植物中的應(yīng)用[J]. 廖鵬飛,聶旺,余雅心,童普國(guó),李紹波,朱友林.  基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué). 2016(02)
[3]纖維素酶的研究進(jìn)展與發(fā)展趨勢(shì)[J]. 顧方媛,陳朝銀,石家驥,錢(qián)世鈞.  微生物學(xué)雜志. 2008(01)



本文編號(hào)：2927628