發(fā)布時(shí)間：2020-10-16 18:10

　　 母源因子是卵子發(fā)生過程中積累的mRNA,蛋白質(zhì)和小RNA,參與調(diào)控精卵融合,染色質(zhì)重塑和母源-合子轉(zhuǎn)換等早期胚胎發(fā)育過程。本實(shí)驗(yàn)利用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選潛在母源基因,并從中選擇一個(gè)基因進(jìn)行敲低驗(yàn)證。Bcl2l10是抗凋亡基因,與卵母細(xì)胞成熟相關(guān),可能參與小鼠早期胚胎發(fā)育。本實(shí)驗(yàn)利用RNAi技術(shù)進(jìn)行敲低,研究其在早期胚胎中的作用。1)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的簡(jiǎn)單分析利用本實(shí)驗(yàn)室單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),對(duì)卵母細(xì)胞-囊胚七個(gè)階段體內(nèi)胚進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。首先我們對(duì)42個(gè)已知母源基因進(jìn)行了表達(dá)模式分析,根據(jù)其表達(dá)規(guī)律,從27238個(gè)差異基因中篩選出135個(gè)潛在的母源基因。最后,通過GO分析,從這些潛在母源基因中選擇Bcl2l10開展深入研究。2)Bcl2l10在卵母細(xì)胞和早期胚胎中的表達(dá)分析通過定量PCR技術(shù)分析Bcl2l10在卵母細(xì)胞和早期胚胎中表達(dá)量,結(jié)果發(fā)現(xiàn):在卵母細(xì)胞和原核胚胎中表達(dá)量最高,2-cell階段降低,4-cell階段表達(dá)量急劇下降,8-cell階段幾乎檢測(cè)不到表達(dá);通過免疫熒光技術(shù)分析其蛋白的定位,結(jié)果顯示:Bcl2l10在卵母細(xì)胞、1-cell和2-cell階段定位于細(xì)胞膜,后期轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)。3)敲低Bcl2l10對(duì)小鼠植入前胚胎發(fā)育的影響在原核胚胎階段進(jìn)行顯微注射,Bcl2l10 mRNA在2-cell階段表達(dá)被抑制,而蛋白在8-cell階段檢測(cè)到被抑制。敲低Bcl2l10導(dǎo)致囊胚發(fā)育率降低,且具有顯著性差異(P0.01)。同時(shí),我們利用Morpholino進(jìn)行敲低驗(yàn)證,得到一致的結(jié)果。上述結(jié)果顯示,敲低Bcl2l10影響了囊胚發(fā)育。因此我們檢測(cè)了囊胚標(biāo)志基因Oct4、Cdx2、Nanog和Sox17。結(jié)果顯示:內(nèi)細(xì)胞團(tuán)發(fā)育相關(guān)基因Oct4、Nanog和Sox17的表達(dá)都被顯著性降低,表明Bcl2l10可能與內(nèi)細(xì)胞團(tuán)發(fā)育相關(guān)。由于Bcl-2家族與細(xì)胞凋亡相關(guān),因此我們檢測(cè)了凋亡相關(guān)基因Bax和Trp53的表達(dá)。結(jié)果顯示:Bax的表達(dá)不受影響;而Trp53在囊胚階段的表達(dá)下降。而敲低Bcl2l10之后,線粒體的活性降低。這表明,Bcl2l10參與線粒體凋亡途徑,并影響Trp53的表達(dá)。綜上,Bcl2l10具有母源基因特征,影響Oct4、Nanog和Sox17的表達(dá),參與內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的發(fā)育。這些結(jié)果表明,我們篩選的母源基因具有一定的可信性,將為哺乳動(dòng)物早期胚胎發(fā)育研究提供新的候選基因。
【學(xué)位單位】：阜陽師范學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：Q953
【部分圖文】：

哺乳動(dòng)物MZT過程圖

Boo序列比對(duì)[82]

已知母源基因熱圖
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本文編號(hào)：2843594