克羅諾桿菌(原稱阪崎腸桿菌)是一種重要的食源性條件致病菌,它可以污染嬰幼兒配方食品,進(jìn)而引起一系列嬰幼兒感染事件,對(duì)嬰幼兒的健康造成嚴(yán)重威脅。克羅諾桿菌污染食品可能與其在食品接觸表面形成生物膜有關(guān),生物膜狀態(tài)下的細(xì)菌不易被清除并廣泛傳播,因此研究克羅諾桿菌的生物膜形成機(jī)制對(duì)控制生物膜引起的食品生產(chǎn)過(guò)程中的交叉污染具有重要意義。此外,食品、環(huán)境及臨床感染病例中均分離出克羅諾桿菌耐藥菌株,耐藥菌株的傳播及耐藥譜的發(fā)展給臨床抗感染治療帶來(lái)巨大挑戰(zhàn),因此加強(qiáng)克羅諾桿菌耐藥性監(jiān)測(cè)及耐藥機(jī)制的探究尤為重要。本論文運(yùn)用脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)方法對(duì)81株克羅諾桿菌食品分離株進(jìn)行分子分型,篩選24株不同PFGE帶型的菌株進(jìn)行生物膜形成能力分析。采用4℃冷脅迫和4℃冷適應(yīng)處理菌株,比較其生物膜形成能力、菌株表面特性和生物膜微觀結(jié)構(gòu)的差異,采用反轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR(qRT-PCR)探究gsiB、luxS、glpQ、sdiA和deoB 5種生物膜相關(guān)基因表達(dá)量的變化規(guī)律,運(yùn)用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)克羅諾桿菌進(jìn)行全基因組測(cè)序及分析,以挖掘與生物膜形成相關(guān)的基因。結(jié)果表明,81株克羅諾桿菌共形成71個(gè)PFGE帶型,帶型總體較分散。37℃條件下,24株克羅諾桿菌都能夠形成生物膜,其中菌株ES183、ES303、ES295、ES305和ES304具有強(qiáng)生物膜形成能力。4℃冷脅迫可促進(jìn)菌株生物膜的形成,其中菌株ES055、ES114、ES215和ES300差異顯著;4℃冷適應(yīng)對(duì)生物膜形成能力幾乎沒(méi)有影響�？肆_諾桿菌為電子供體,4℃培養(yǎng)降低菌株的供電子能力。37℃培養(yǎng)條件下,各菌株的表面疏水性存在差異,其中菌株ES017、ES298和ES299的疏水性較大,4℃培養(yǎng)菌株的表面疏水性降低。4℃冷脅迫和4℃冷適應(yīng)菌株在不銹鋼載片表面均有一定量的菌體粘附,菌株ES017、ES055和ES114形成微菌落,菌株ES113僅有少量散落的菌體。相較于37℃陽(yáng)性對(duì)照菌株,4℃冷脅迫菌株的gsiB、luxS、glpQ、sdiA和deoB基因表達(dá)量下調(diào);除少數(shù)菌株外,4℃冷適應(yīng)菌株的gsiB、luxS、glpQ和sdiA基因表達(dá)量下調(diào),deoB基因表達(dá)量上調(diào)�？肆_諾桿菌全基因組中發(fā)現(xiàn)33種調(diào)控細(xì)菌生物粘附的基因,如chiA、chiA-2、chiA-2、csgA-1、csgB、eae-1、eae-2、elfA、elfA-1、elfA-2、fimA、fimA-1、fimA-2、hifA、mrpA、papH、papH-1、papH-2、sfaH、smfA、mrkD、sfaS-1、sfaS-2、sfaS-3、sfaS-4、sfaS-5、fliD、prn、elfG、ycbV、nlpE、znuA、ydeH。此外,本實(shí)驗(yàn)還研究了克羅諾桿菌的耐藥性。采用Phoenix?-100全自動(dòng)微生物鑒定及藥敏系統(tǒng)對(duì)305株克羅諾桿菌進(jìn)行包括阿米卡星、慶大霉素、阿莫西林-克拉維酸、哌拉西林-他唑巴坦、氨芐西林-舒巴坦、氨芐西林、哌拉西林、頭孢唑啉、頭孢吡肟、頭孢噻肟、頭孢他啶、氯霉素、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、亞胺培南、美羅培南、氨曲南、四環(huán)素、復(fù)方新諾明共19種抗生素的藥敏檢測(cè)。結(jié)果表明,305株克羅諾桿菌中對(duì)頭孢唑啉和四環(huán)素耐藥的菌株分別為8株和2株;對(duì)頭孢唑啉和氯霉素中介的菌株分別為79株和8株;其中菌株ES008對(duì)四環(huán)素耐藥且對(duì)氯霉素中介,菌株ES024、ES029和ES059對(duì)頭孢唑啉和氯霉素同時(shí)中介;所有菌株對(duì)所測(cè)試的其余16種抗生素均敏感。在藥敏檢測(cè)的基礎(chǔ)上,選取6株頭孢唑啉耐藥菌株、2株四環(huán)素耐藥菌株、2株敏感菌株進(jìn)行全基因組測(cè)序和分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)6種可能與頭孢唑啉耐藥相關(guān)的基因ampC、ompC、ompN、ompF、phoE、tolC,頭孢唑啉耐藥和敏感菌株的基因序列比對(duì)發(fā)現(xiàn),基因ampC、ompC、ompF、phoE和tolC堿基差異較大;2種四環(huán)素耐藥基因tetR和tetA,共編碼14種蛋白TetR、TetG、TetY、Tet41、TetE、Tet39、TetJ、TetH、TetA、TetB、Tet30、Tet31、Tet33、TetZ。
【學(xué)位單位】：武漢輕工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：TS201.3
【部分圖文】：

技術(shù)路線圖

武漢輕工大學(xué)碩士學(xué)位論文實(shí)驗(yàn)結(jié)果 菌落計(jì)數(shù)結(jié)果減少生物量所導(dǎo)致的實(shí)驗(yàn)結(jié)果偏差，以培養(yǎng)菌株初始活菌數(shù)量級(jí)是否達(dá)到 1mL 為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)[64]。陽(yáng)性對(duì)照菌株菌落計(jì)數(shù)結(jié)果為 7.5~15.4×108mL，冷適應(yīng)菌株菌落計(jì)數(shù)結(jié)果為 3.9~7.2×108CFU/mL（圖 3.1）。經(jīng) 4℃冷處羅諾桿菌仍能在 BHI 液體培養(yǎng)基中保持生長(zhǎng)，但活菌總數(shù)同 37℃陽(yáng)性對(duì)照菌有所減少，37℃陽(yáng)性對(duì)照及 4℃冷適應(yīng)菌株活菌數(shù)數(shù)量級(jí)都達(dá)到 108mL。由于 4℃冷脅迫菌株和 37℃陽(yáng)性對(duì)照菌株初始的培養(yǎng)條件相同，即菌落總，所以此處未給出 4℃冷脅迫菌株菌落計(jì)數(shù)結(jié)果。

3.2 克羅諾桿菌 37℃陽(yáng)性對(duì)照組、4℃冷脅迫組、4℃冷適應(yīng)組菌株的總細(xì)胞量2 Total cell number by 37℃ positive control strain, 4℃ cold-stressed strains and 4℃ coldadapted strains of Cronobacter不同條件下生物膜形成量諾桿菌在 4℃冷脅迫、4℃冷適應(yīng)和 37℃陽(yáng)性對(duì)照條件下生物膜形成情況示�？肆_諾桿菌屬不同種之間生物膜形成能力差異不顯著（P＞0.05）。3條件下靜止培養(yǎng) 24h 后，所有菌株都能夠形成一定量的生物膜，菌株ES303、ES295、ES305 和 ES304 表現(xiàn)出較強(qiáng)的生物膜形成能力nm＞0.1），其中菌株 ES183 為 C.sakazakii，來(lái)源于黑龍江的配方粉，菌株 C.universalis，來(lái)源于北京的方便面，菌株 ES295、ES305 和 ES304 均為nsis，ES295 為 C.turicensis 標(biāo)準(zhǔn)菌株，菌株 ES305 和 ES304 來(lái)源于洋蔥圈條件下，菌株ES086、ES055、ES071、ES042、ES114、ES113、ES031、ES024、ES165、ES216、ES294、ES298、ES302 和 ES299 表現(xiàn)出中等生物膜形成能力；
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本文編號(hào)：2842402