多酶級聯(lián)反應(yīng)體系能夠以高效的方式完成催化作用,反應(yīng)的中間產(chǎn)物在不同酶的活性位點之間轉(zhuǎn)運。這一機制可以保持中間體的高局部濃度以及減少運輸過程中的擴散損失,促進了整體催化效率的提高。受此啟發(fā),仿生構(gòu)建多酶級聯(lián)反應(yīng)也越來越多引起研究者的關(guān)注。其中,甲醇脫氫酶(Methanol dehydrogenase,FDH)-甲醛脫氫酶(Formaldehyde dehydrogenase,FalDH)-乙醇脫氫酶(Alcohol dehydrogenase,ADH)-谷氨酸脫氫酶(Glutamate dehydrogenase,GDH)級聯(lián)反應(yīng)體系與堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase,AKP)-酪氨酸酶(Tyrosinase,TYR)級聯(lián)反應(yīng)具有重要的研究價值。FDH-FalDH-ADH-GDH級聯(lián)反應(yīng)能夠在溫和的條件下高效地將二氧化碳還原為甲醇,對于二氧化碳的固定化與溫室效應(yīng)的緩解有著重要的意義。而AKP-TYR級聯(lián)反應(yīng)的底物鄰-磷酸-L-酪氨酸可以抑制人類腎臟和乳腺癌細胞的生長,對其研究有重要的醫(yī)學價值。結(jié)合多酶級聯(lián)反應(yīng)體系中高效的協(xié)同催化機理,通過酶固定化,開發(fā)新型的多酶體系共固定化技術(shù),具有非常重要的科學意義與應(yīng)用價值。酶固定化的方法主要有四種,即吸附、共價鍵合、包埋和交聯(lián)。其中,包埋不需要對酶進行修飾改性,所以在很大程度上保留了酶的原有結(jié)構(gòu),使得其酶活損失較少。MOF材料因具有其超高的比表面積、大部分生物相容性好、可調(diào)節(jié)的孔尺寸和功能結(jié)構(gòu)以及良好的熱穩(wěn)定性等特性,使其成為良好的酶固定化載體材料。在此基礎(chǔ)上,將固定化酶與分離膜相結(jié)合,構(gòu)建酶膜反應(yīng)器可以使得酶催化與產(chǎn)物分離同時進行,進一步提高了反應(yīng)效率。本文構(gòu)建了兩種多酶級聯(lián)反應(yīng)體系:FDH-FalDH-ADH-GDH級聯(lián)反應(yīng)體系和AKP-TYR級聯(lián)反應(yīng)體系。將FDH與GDH、FalDH與GDH、ADH與GDH分別原位包埋于ZIF-8內(nèi),構(gòu)建出FDH-FalDH-ADH-GDH級聯(lián)反應(yīng)體系,用于將還原CO_2為甲醇的催化反應(yīng)。此外,本文將還原型輔酶Ⅰ與脫氫酶一起包埋與ZIF-8內(nèi),構(gòu)建級聯(lián)反應(yīng)�；谏鲜雒腹潭ɑ椒�,進一步地將固定化酶與分離膜結(jié)合,在膜孔內(nèi)構(gòu)建FDH-FalDH-ADH-GDH級聯(lián)反應(yīng)體系,使催化與分離同步進行。此外,本文還將競爭可逆抑制劑為具有長脂肪鏈的“兩親”分子,利用親和吸附法定向誘導(dǎo)酪氨酸酶與堿性磷酸酶共同固定在載玻片上,構(gòu)建出了AKP-TYR級聯(lián)反應(yīng)體系。由上述研究工作,得到以下結(jié)論:(1)將輔酶與酶共同被包埋至ZIF-8內(nèi)可以解決其傳質(zhì)速度較慢和和NADH損耗較大的問題,其催化效率較提高了約15%。(2)當引入了酶膜反應(yīng)器后,FDH-FalDH-ADH-GDH多酶級聯(lián)反應(yīng)催化效率得到了進一步提升。(3)對于FDH-FalDH-ADH-GDH多酶級聯(lián)反應(yīng)體系而言,無序固定化酶膜反應(yīng)器的催化活性劣于有序固定化酶膜反應(yīng)器。(4)與抑制劑結(jié)合后制備的固定化的多酶體系較普通固定化的多體系酶活性更高,提高了約有72%。這可能是因為酶與抑制劑反應(yīng)后可以使得酶的活性位點朝上,有利于酶促反應(yīng)的進行。
【學位單位】：浙江理工大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：Q55
【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 緒論
    1.1 多酶級聯(lián)反應(yīng)體系
        1.1.1 多酶級聯(lián)反應(yīng)體系的分類
        1.1.2 FDH-FalDH-ADH級聯(lián)反應(yīng)
        1.1.3 AKP-TYR級聯(lián)反應(yīng)
    1.2 多酶級聯(lián)反應(yīng)體系共固定化
        1.2.1 吸附法固定多酶級聯(lián)反應(yīng)體系
        1.2.2 包埋法固定多酶級聯(lián)反應(yīng)體系
        1.2.3 共價鍵合法固定多酶級聯(lián)反應(yīng)體系
        1.2.4 交聯(lián)法固定多酶級聯(lián)反應(yīng)體系
        1.2.5 生物親和作用固定多酶級聯(lián)反應(yīng)體系
    1.3 酶膜反應(yīng)器
        1.3.1 酶膜反應(yīng)器的分類
        1.3.2 酶膜反應(yīng)器的應(yīng)用
    1.4 酶抑制劑
        1.4.1 酪氨酸酶抑制劑
        1.4.2 堿性磷酸酶抑制劑
    1.5 課題的意義與主要研究內(nèi)容
        1.5.1 課題的意義與提出
        1.5.2 本課題的主要研究內(nèi)容
第二章 MOF共固定化多酶體系還原二氧化碳
    2.1 引言
    2.2 實驗部分
        2.2.1 實驗材料與試劑
        2.2.2 enzymes/ZIF-8 復(fù)合物的合成與表征
            2.2.2.1 FDH&GDH/ZIF-8 的合成
            2.2.2.2 FalDH&GDH/ZIF-8 的合成
            2.2.2.3 ADH&GDH/ZIF-8 的合成
        2.2.3 enzymes&coenzyme/ZIF-8 復(fù)合物生物合成與表征
            2.2.3.1 FDH&GDH&NADH/ZIF-8 的合成
            2.2.3.2 FalDH&GDH&NADH/ZIF-8 的合成
            2.2.3.3 ADH&GDH&NADH/ZIF-8 的合成
            2.2.3.4 enzymes&coenzyme/ZIF-8 復(fù)合物的表征
        2.2.4 多酶級聯(lián)反應(yīng)的構(gòu)建
    2.3 結(jié)果與討論
        2.3.1 enzymes/ZIF-8 復(fù)合物的表征
            2.3.1.1 掃描電鏡分析
            2.3.1.2 X-射線衍射分析
            2.3.1.3 熱重分析
            2.3.1.4 比表面積與孔徑分析
        2.3.2 enzyme&coenzyme/MOF復(fù)合物的表征
            2.3.2.1 掃描電鏡分析
            2.3.2.2 X射線衍射分析
            2.3.2.3 熱重分析
            2.3.2.4 表面積與孔徑分析
        2.3.3 FDH-FalDH-ADH-GDH多酶級聯(lián)反應(yīng)的構(gòu)建
    2.4 小結(jié)
第三章 有序固定化酶膜反應(yīng)器還原二氧化碳
    3.1 引言
    3.2 實驗部分
        3.2.1 實驗材料與試劑
        3.2.2 PDMS/PADF復(fù)合膜的合成與表征
            3.2.3.1 PDMS/PADF復(fù)合膜的合成
            3.2.3.2 PDMS/PADF復(fù)合膜的表征
        3.2.3 酶膜反應(yīng)器的制備與表征
            3.2.3.1 酶膜反應(yīng)器的制備
            3.2.3.2 酶膜反應(yīng)器的表征
        3.2.4 酶膜反應(yīng)器裝置及實驗
            3.2.4.1 實驗裝置
            3.2.4.2 酶膜反應(yīng)器還原二氧化碳合成甲醇的研究
    3.3 結(jié)果與討論
        3.3.1 PDMS/PVDF復(fù)合膜的表征
        3.3.2 酶膜反應(yīng)器的表征
        3.3.3 酶膜反應(yīng)器還原二氧化碳為甲醇的研究
            3.3.3.1 酶膜反應(yīng)器的酶固定化類型對催化活性的影響
            3.3.3.2 滲透通量對酶膜反應(yīng)器催化活性的影響
            3.3.3.3 反應(yīng)時間對酶膜反應(yīng)器催化活性的影響
    3.4 小結(jié)
第四章 酪氨酸酶和堿性磷酸酶雙酶體系共固定化
    4.1 引言
    4.2 實驗部分
        4.2.1 實驗材料與試劑
        4.2.2 抑制劑的修飾與表征
            4.2.2.1 β-熊果苷的修飾與表征
            4.2.2.2 聯(lián)苯胺的修飾
        4.2.3 修飾后的抑制劑的抑制類型與可逆性測定
            4.2.3.1 β-熊果苷衍生物抑制類型與可逆性的測定
            4.2.3.2 聯(lián)苯胺衍生物抑制類型與可逆性的測定
        4.2.4 酶的純化
            4.2.4.1 酪氨酸酶的純化
            4.2.4.2 堿性磷酸酶的純化
        4.2.5 吸附法固定酪氨酸酶和堿性磷酸酶
        4.2.6 載酶量的測定
        4.2.7 AKP-TYR級聯(lián)反應(yīng)的構(gòu)建
    4.3 結(jié)果與討論
        4.3.1 抑制劑衍生物的表征
            4.3.1.1 β-熊果苷衍生物
            4.3.1.2 聯(lián)苯胺衍生物
        4.3.2 改性抑制劑的抑制類型與可逆性
            4.3.2.1 β-熊果苷衍生物的抑制類型與可逆性
            4.3.2.2 聯(lián)苯胺衍生物的抑制類型與可逆性
        4.3.3 載酶量的測定
        4.3.4 AKP-TYR級聯(lián)反應(yīng)的構(gòu)建
    4.4 小結(jié)
第五章 總結(jié)與展望
參考文獻
攻讀學位期間研究成果
致謝

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本文編號：2840009