自然界中的病源微生物無處不在,它們通過不同的途徑進入植物體內(nèi),寄宿在植物體細胞間,導(dǎo)致植物產(chǎn)生病害。糖基轉(zhuǎn)移酶是一類負責(zé)糖基化修飾的酶,它能將糖基從供體轉(zhuǎn)移到受體分子上,從而改變受體分子的穩(wěn)定性、水溶性等,進而對植物生長發(fā)育和適應(yīng)環(huán)境中起著重要作用。根據(jù)公開獲得的芯片數(shù)據(jù)和發(fā)表的文獻得知,擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶基因UGT73C4受病原菌和水楊酸(SA)誘導(dǎo)上調(diào)表達,這暗示著UGT73C4基因可能參與擬南芥的生物脅迫。為了明確糖基轉(zhuǎn)移酶UGT73C4的生物學(xué)功能,開展了本課題研究。首先用病原細菌Pst DC3000處理兩周齡的野生型擬南芥,并用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測了UGT73C 基因在病原細菌處理不同時間后的表達水平。結(jié)果顯示,UGT73C4受病原菌誘導(dǎo)上調(diào)表達,且在24h上調(diào)最為明顯。同時,又用病原細菌Pst DC3000處理由UGT73C4啟動子驅(qū)動GUS基因表達的轉(zhuǎn)基因株系,發(fā)現(xiàn)在病原細菌處理后,轉(zhuǎn)基因植物葉片組織的GUS染色顯著加深。另外,還檢測到UGT73C4基因受SA誘導(dǎo)表達。這些結(jié)果說明糖基轉(zhuǎn)移酶基因UGT73C4受病原細菌Pst DC3000和SA誘導(dǎo)表達,可能參與植物的抗病反應(yīng)。在獲得了UGT73C4基因的過表達株系和敲除株系材料后,我們用Pst DC3000分別注射UGT73C4的敲除株系、過表達株系和野生型株系,發(fā)現(xiàn)UGT73C4過表達株系的病菌數(shù)量顯著少于野生型和突變體株系,證明糖基化轉(zhuǎn)移酶UGT73C4參與植物抗病反應(yīng),同時利用煙草瞬時轉(zhuǎn)化實驗也進一步證明了糖基轉(zhuǎn)移酶UGT73C4參與植物免疫反應(yīng)。在此基礎(chǔ)上,進一步探索了UGT73C4基因在植物應(yīng)對生物脅迫中的作用機制。通過DAB和NBT等組織化學(xué)染色實驗發(fā)現(xiàn)UGT73C4過表達株系有明顯的活性氧積累,通過qPCR檢測發(fā)現(xiàn)與SA信號途徑有關(guān)的PRl、PR2等抗病響應(yīng)基因在過表達株系中明顯上調(diào),推測UGT73C4可能是通過SA途徑參與植物抗病的。進一步檢測了SA合成相關(guān)基因或者SA合成調(diào)節(jié)基因,發(fā)現(xiàn)在病原細菌處理后,UGT73C4過表達株系中EDS1、PAD4、ICS7等基因表達水平均顯著高于突變株系和野生型擬南芥。通過高效液相色譜結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)分析檢測了病原細菌處理后24h的不同基因型株系中SA的含量,發(fā)現(xiàn)不論是自由態(tài)的SA還是總SA含量,在過表達株系中均明顯高于野生型和突變體植株。證明糖基轉(zhuǎn)移酶UGT73C4是通過SA的積累,進而增強植物的抗病性。本研究還發(fā)現(xiàn)糖基轉(zhuǎn)移酶基因UGT73C4受土壤病原真菌Foc699誘導(dǎo)表達上調(diào)。我們用帶GFP標(biāo)簽的Foc699菌株處理UGT73C4的敲除株系、過表達株系和野生擬南芥,通過熒光顯微鏡發(fā)現(xiàn)過表達株系根上的真菌Foc699熒光含量明顯少于突變體和野生型。在病原真菌Foc699侵染各基因型株系的根部并轉(zhuǎn)入土壤繼續(xù)培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)過表達株系長勢明顯好于突變體和野生型株系,說明糖基轉(zhuǎn)移酶UGT73C4能夠提高植物地下部分對土傳病原菌的抗性。同時,發(fā)現(xiàn)過表達株系在根中與茉莉酸(JA)和抗真菌相關(guān)的標(biāo)志基因上調(diào)表達,反映出UGT73C4導(dǎo)致的植物根系抗病可能涉及到JA信號途徑。本研究還構(gòu)建了UGT73C4基因的原核表達載體,純化了在細菌中表達的糖基轉(zhuǎn)移酶UGT73C4,對植物的某些天然代謝物進行了酶活性分析,但目前尚未確定該糖基轉(zhuǎn)移酶的作用底物�？傊�,本論文通過對UGT73C4基因的突變體和過表達體的一系類研究,明確了糖基轉(zhuǎn)移酶UGT73C4在植物地上部和地下部抗病響應(yīng)中發(fā)揮著重要作用,初步說明UGT73C4導(dǎo)致的抗病響應(yīng)可能與SA以及JA信號途徑有關(guān)。但是更深層的抗病機理還需要進一步研究。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：Q943.2;S432.23
【部分圖文】：

圖３－１－１?Ｃ／Ｇ７７３ＣＷ基因表達受病原細菌和ＳＡ的類似物ＩＮＡ誘導(dǎo)??Ａ：?ＤＣ３０００?處理?Ｂ：?ＩＮＡ?處理??１．２?ｔ／Ｇ７７ＪＣ／啟動子：ＧＵＳ轉(zhuǎn)基因植株的獲得和基因表達模式分析??１．２．１?啟動子克隆??為了研宄基因在擬南芥植株的具體表達部位以及進一步驗證受病??原菌和ＳＡ的誘導(dǎo)表達情況，我們克隆了?的啟動子。根據(jù)ＴＡＩＲ網(wǎng)站??（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．ｏｒｇ）提供的序列信息，確定ｔ／ＧＴ７３Ｃ＾基因起始密碼前??１５００ｂｐ的ＤＮＡ序列作為該基因的啟動子區(qū)域。設(shè)計啟動子特異引物，然后利用??高保真Ｔａｑ酶和ＰＣＲ技術(shù)從擬南芥基因組ＤＮＡ擴增出該啟動子序列，如圖３－１－２。??將擴增的啟動子序列連接到ｐＥａｓｙ－Ｂｌｕｎｔ?Ｓｉｍｐｌｅ?Ｃｌｏｎｉｎｇ?Ｋｉｔ提供的載體上，經(jīng)過??藍白斑篩選，篩選出白色陽性菌落。挑取單菌落，經(jīng)ＰＣＲ和測序驗證啟動子序??列是正確的。??

圖３－１－２?｛／Ｇ７７３ＣＷ啟動子的擴增??Ｍ：?ＤＮＡ?ｍａｒｋｅｒ?１：?ｔ／Ｇ７７３ＣＶ?啟動子序列??動子：ＧＵＳ載體構(gòu)建與轉(zhuǎn)基因株系的篩選??隆載體上提取質(zhì)粒，然后用及？Ｈ?Ｉ和／／／ｍｉｎｉ進行酶切，段進行回收后連接到ＰＢＩ１２１載體上，替換載體上的３５Ｓ轉(zhuǎn)化、篩選、單菌落ＰＣＲ分析和測序驗證，然后轉(zhuǎn)化感染擬南芥。獲得轉(zhuǎn)基因株系后用ＰＣＲ驗證轉(zhuǎn)基因成功的引物擴增，轉(zhuǎn)基因株系能擴出啟動子的條帶，而非轉(zhuǎn)基因啟動子載體構(gòu)建與轉(zhuǎn)基因株系的篩選如圖３－１－３。??

圖３－１－３載體構(gòu)建與篩選??Ａ：?啟動子：ＧＵＳ載體轉(zhuǎn)化細菌的藍白斑篩選??Ｂ：?ｉ／Ｇ７７ｊＧ＾啟動子：ＧＵＳ載體的酶切驗證（５卿１１１＋／／加＜１１１１）??Ｃ：轉(zhuǎn)基因綠苗篩選?Ｄ：轉(zhuǎn)基因植株的ＰＣＲ驗證??．２．３?在不同組織的表達分析??獲得ｆ／Ｇ７７３ＣＶ啟動子：ＧＵＳ轉(zhuǎn)基因擬南芥植株后，我們對其不同發(fā)育時期??不同組織部位進行ＧＵＳ染色，發(fā)現(xiàn)ｔ／Ｇ７７３ＣＷ基因主要在１周大小幼苗期子??、根尖、真葉處表達，而在生長２周后的楦株葉片和根中表達都很弱，開花抽??以后只在花、果中有較弱的表達。如圖３－１－４。??
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本文編號：2839921