發(fā)布時間：2020-10-12 06:40

　　 目的:將能夠表達犬FGF21的真核質粒pCMV3-His-dFGF21轉染至中國倉鼠卵巢細胞(CHOK-1)中,利用潮霉素B進行篩選,獲得穩(wěn)定表達犬FGF21的CHOK-1細胞系;利用該重組細胞系對犬FGF21進行表達,獲得具有生物學活性的犬FGF21;對該細胞系的培養(yǎng)工藝、表達條件進行優(yōu)化,為犬FGF的工藝化生產提供理論實踐依據,為犬FGF21的寵物用藥研制奠定基礎。方法:利用三種不同轉染方法:脂質體轉染法?磷酸鈣沉淀法?電穿孔法對真核質粒pCMV3-His-dFGF21進行轉染,Western blot法驗證蛋白表達情況,篩選最適轉染方法。潮霉素B篩選法構建穩(wěn)定表達犬FGF21的CHO細胞系,RT-PCR和Western blot驗證轉染效果,繪制生長曲線監(jiān)測細胞生長情況,使用CCK8監(jiān)測細胞活力以評價細胞狀態(tài),對穩(wěn)轉細胞系進行理化性質鑒定。設計正交實驗,對血清濃度(8%?10%?15%)?細胞接種密度(30%?40%?50%)和不同表達時長(36,48,72 h)三種細胞培養(yǎng)與蛋白表達條件進行研究,利用SDS-PAGE蛋白電泳以及Gel Quant Express軟件分析FGF21表達情況,優(yōu)化穩(wěn)轉細胞系培養(yǎng)條件。超聲法破碎細胞,Ni-Agarose親和層析法對蛋白進行柱純化,獲得大量FGF21,并對其理化性質進行鑒定。結果:比較三種轉染方法,確定脂質體轉染細胞效果最佳。使用MTT法檢測細胞活力,得到最佳潮霉素B篩選濃度為200μg/mL,并成功篩出表達犬成纖維細胞生長因子蛋白FGF21的細胞系,RT-PCR和WB結果顯示,該細胞系能夠成功表達犬FGF21蛋白,穩(wěn)轉細胞系構建成功;根據正交試驗優(yōu)化出最適表達條件:細胞接種密度40%?血清濃度為15%?表達時間為72 h。目標蛋白在100 mmol/L的咪唑條件下被成功洗脫純化。結論:選用陽離子脂質體轉染法轉染細胞,潮霉素B篩選成功得到穩(wěn)定表達犬成纖維細胞生長因子FGF21細胞系,對該細胞系的培養(yǎng)條件進行優(yōu)化后,目的蛋白可有效表達,并對該蛋白進行純化,為接下來探究蛋白功能提供了實驗依據。
【學位單位】：吉林農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：Q78
【部分圖文】：

第二篇 研究內容 真核質粒驗證與穩(wěn)定表達犬 FGF21CHOK-1 細胞的篩選材料 試劑 儀器要材料MV3-His-dFGF21 真核質粒（購自 Sino Biological 公司 ），pCMV3-His 空載5α 大腸桿菌感受態(tài)細胞、CHOK-1 細胞均來自吉林農業(yè)大學病原微生物與免。

圖 1.2.犬 FGF21 基因 PCRM．DL2000DNA Marker1. FGF21PCR 產物電泳Figure1.2 Canis FGF21gene PCR pro

23 1.3 真核重組質粒 pCMV 3-FGF21-His 雙酶切ukaryotic recombinant plasmid pCMV3-FGF21electrophoresis map Marker 1. pCMV3-FGF21-His 質粒 2. pCMV產物 Marker 1. pCMV3-FGF21-His plasmid 2. pCMdouble digestion product
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本文編號：2837796