目的:將能夠表達(dá)犬FGF21的真核質(zhì)粒pCMV3-His-dFGF21轉(zhuǎn)染至中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHOK-1)中,利用潮霉素B進(jìn)行篩選,獲得穩(wěn)定表達(dá)犬FGF21的CHOK-1細(xì)胞系;利用該重組細(xì)胞系對(duì)犬FGF21進(jìn)行表達(dá),獲得具有生物學(xué)活性的犬FGF21;對(duì)該細(xì)胞系的培養(yǎng)工藝、表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化,為犬FGF的工藝化生產(chǎn)提供理論實(shí)踐依據(jù),為犬FGF21的寵物用藥研制奠定基礎(chǔ)。方法:利用三種不同轉(zhuǎn)染方法:脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法?磷酸鈣沉淀法?電穿孔法對(duì)真核質(zhì)粒pCMV3-His-dFGF21進(jìn)行轉(zhuǎn)染,Western blot法驗(yàn)證蛋白表達(dá)情況,篩選最適轉(zhuǎn)染方法。潮霉素B篩選法構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)犬FGF21的CHO細(xì)胞系,RT-PCR和Western blot驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果,繪制生長(zhǎng)曲線監(jiān)測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)情況,使用CCK8監(jiān)測(cè)細(xì)胞活力以評(píng)價(jià)細(xì)胞狀態(tài),對(duì)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系進(jìn)行理化性質(zhì)鑒定。設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn),對(duì)血清濃度(8%?10%?15%)?細(xì)胞接種密度(30%?40%?50%)和不同表達(dá)時(shí)長(zhǎng)(36,48,72 h)三種細(xì)胞培養(yǎng)與蛋白表達(dá)條件進(jìn)行研究,利用SDS-PAGE蛋白電泳以及Gel Quant Express軟件分析FGF21表達(dá)情況,優(yōu)化穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系培養(yǎng)條件。超聲法破碎細(xì)胞,Ni-Agarose親和層析法對(duì)蛋白進(jìn)行柱純化,獲得大量FGF21,并對(duì)其理化性質(zhì)進(jìn)行鑒定。結(jié)果:比較三種轉(zhuǎn)染方法,確定脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染細(xì)胞效果最佳。使用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力,得到最佳潮霉素B篩選濃度為200μg/mL,并成功篩出表達(dá)犬成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子蛋白FGF21的細(xì)胞系,RT-PCR和WB結(jié)果顯示,該細(xì)胞系能夠成功表達(dá)犬FGF21蛋白,穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系構(gòu)建成功;根據(jù)正交試驗(yàn)優(yōu)化出最適表達(dá)條件:細(xì)胞接種密度40%?血清濃度為15%?表達(dá)時(shí)間為72 h。目標(biāo)蛋白在100 mmol/L的咪唑條件下被成功洗脫純化。結(jié)論:選用陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染細(xì)胞,潮霉素B篩選成功得到穩(wěn)定表達(dá)犬成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子FGF21細(xì)胞系,對(duì)該細(xì)胞系的培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化后,目的蛋白可有效表達(dá),并對(duì)該蛋白進(jìn)行純化,為接下來(lái)探究蛋白功能提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【學(xué)位單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類(lèi)】：Q78
【部分圖文】：

第二篇 研究?jī)?nèi)容 真核質(zhì)粒驗(yàn)證與穩(wěn)定表達(dá)犬 FGF21CHOK-1 細(xì)胞的篩選材料 試劑 儀器要材料MV3-His-dFGF21 真核質(zhì)粒（購(gòu)自 Sino Biological 公司 ），pCMV3-His 空載5α 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞、CHOK-1 細(xì)胞均來(lái)自吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)病原微生物與免。

圖 1.2.犬 FGF21 基因 PCRM．DL2000DNA Marker1. FGF21PCR 產(chǎn)物電泳Figure1.2 Canis FGF21gene PCR pro

23 1.3 真核重組質(zhì)粒 pCMV 3-FGF21-His 雙酶切ukaryotic recombinant plasmid pCMV3-FGF21electrophoresis map Marker 1. pCMV3-FGF21-His 質(zhì)粒 2. pCMV產(chǎn)物 Marker 1. pCMV3-FGF21-His plasmid 2. pCMdouble digestion product
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本文編號(hào)：2837796