發(fā)布時間：2020-10-12 06:50

　　 人體腸道微生物組是一個復雜的微生物聯(lián)合體,其中組成成分之一的細菌已經(jīng)受到了相當多的關注,被認為是影響宿主健康的重要因素。除此之外,近年來人體腸道噬菌體的功能和生理學意義也逐漸開始被研究。乳桿菌是人體腸道中發(fā)揮益生功能的主要菌屬,前噬菌體在乳桿菌中普遍存在且具有改變生存形式的潛力,因此隱藏在乳桿菌中的前噬菌體具有哪些特征,以及是否會對腸道菌群及健康產(chǎn)生影響是值得去探索的問題。本研究通過對639株乳桿菌進行前噬菌體位點的預測,旨在分析乳桿菌攜帶前噬菌體的分布特征、功能基因及進化方向;進而使用絲裂霉素C對207株乳桿菌菌株進行溶源性噬菌體的誘導,評估其可被誘導釋放的潛力,同時通過雙層平板法、透射電鏡觀察、基因組提取測序等實驗研究其宿主侵染范圍、形態(tài)特征及功能基因;最后通過給C57BL/6J小鼠灌胃溶源性噬菌體來研究其對腸道菌群的結構影響,從而探索其對宿主腸道健康的潛在作用,為乳桿菌噬菌體的多樣性以及噬菌體影響腸道菌群等方面研究與應用提供數(shù)據(jù)支持和理論依據(jù)。主要研究結果如下:首先,經(jīng)預測發(fā)現(xiàn),639株乳桿菌中的489株攜帶832個完整的前噬菌體;不同種屬乳桿菌攜帶前噬菌體數(shù)量存在差異,植物乳桿菌和副干酪乳桿菌的菌株攜帶兩個以上的前噬菌體比例分別為81.1%和64.0%,而發(fā)酵乳桿菌、格氏乳桿菌、鼠李糖乳桿菌及唾液乳桿菌的比例僅為20.0%~31.0%;不同分離源的菌株攜帶前噬菌體數(shù)量同樣存在差異,分離自糞便的乳桿菌菌株有71.7%只攜帶一個或不攜帶前噬菌體,而分離自發(fā)酵食品的菌株有74.6%攜帶兩個及以上的前噬菌體,表明分離自發(fā)酵食品的乳桿菌攜帶前噬菌體數(shù)量較多。第二,對預測得到的832個乳桿菌前噬菌體進行基因組分析發(fā)現(xiàn):其基因組平均大小為39.90±14.93 Kb,GC含量為30.78%~49.77%,與宿主基本一致;部分前噬菌體會通過基因交換和水平轉移賦予乳桿菌適應生境的功能基因。通過計算平均核苷酸一致性研究乳桿菌前噬菌體整體系統(tǒng)進化的規(guī)律,發(fā)現(xiàn)影響乳桿菌前噬菌體的系統(tǒng)進化方向的主因素是宿主物種。第三,207株乳桿菌中有29株可被誘導并釋放噬菌體。發(fā)酵乳桿菌、格氏乳桿菌、唾液乳桿菌及短乳桿菌中可誘導菌株比例大于20.0%,副干酪乳桿菌可誘導比例約為5.8%,而鼠李糖乳桿菌及植物乳桿菌所有受試菌株均不可誘導。29株乳桿菌溶源性噬菌體宿主范圍高度專一,頭部為直徑約68 nm~85 nm的多面體形狀,伴有一條長度為136 nm~203 nm的收縮或非收縮的尾絲。乳桿菌溶源性噬菌體大多數(shù)可注釋的功能基因都屬于溶源、包裝、復制、形態(tài)發(fā)生及裂解這五個最主要的功能模塊。最后,通過對小鼠灌胃乳桿菌溶源性噬菌體發(fā)現(xiàn),乳桿菌的溶源性噬菌體對小鼠體重增量有一定的抑制作用。在腸道菌群方面,乳桿菌溶源性噬菌體干預早期會使小鼠腸道菌群α多樣性增加,但隨著干預時間的延長會持續(xù)降低;β多樣性會在第42天發(fā)生顯著變化。乳桿菌溶源性噬菌體的持續(xù)干預會降低擬桿菌門的相對豐度并提高放線菌門及厚壁菌門的相對豐度;屬水平上,擬桿菌屬相對豐度降低,梭菌目未鑒定屬及雙歧桿菌屬相對豐度明顯升高,表明乳桿菌溶源性噬菌體會影響腸道菌群多樣性和結構組成。
【學位單位】：江南大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：TS201.3
【部分圖文】：

圖 1-1 烈性噬菌體的溶菌周期及溶源性噬菌體的溶源周期Fig. 1-1 The lytic cycle of virulent phage and the lysogenic cycle of lysogenic phage.3 人體腸道中的噬菌體約半世紀之前，研究者們就發(fā)現(xiàn)有豐富多樣的非病原體病毒群落（主要是噬菌體）于哺乳動物的腸道[61]。然而直到最近十年，雖然微生物組的細菌成分已經(jīng)受到相當關注，但是相對說關于人腸道相關噬菌體群體的組成和生理學意義卻知之甚少。這是由于工具及技術手段非常有限：通常使用透射電子（TEM）和落射熒光顯微鏡FM）直接觀察和計數(shù)病毒樣顆粒（VLPs），這種方法有助于揭示病毒形態(tài)類型的多；或者通過在體外分離單個細菌來用于感染特定培養(yǎng)物中的噬菌體。直到高通量宏組測序技術的出現(xiàn)，使人們能夠更為清晰直觀地理解人類腸道噬菌體群體的復雜性豐富性[62,63]。第一個糞便病毒的宏基因組研究表明，腸道中大多數(shù)細菌病毒1.0%~93.0%）是未知的，既不能明確分類也不能與細菌宿主相關聯(lián)[64, 65]。由于人類噬菌體具有高度個體特異性，不同樣本之間只有很小的重疊[64]，所以腸道噬菌體分成及群體結構等方面的知識空白被稱作“病毒暗物質”[66]。通常認為，細菌群體中

1 緒論平板法、透射電鏡觀察、基因組提取測序等實驗研究其宿主侵染范圍、形態(tài)特征及功能基因。（3）探索乳桿菌溶源性噬菌體對腸道菌群的影響將分離得到的溶源性噬菌體對健康小鼠進行為期六周的灌胃實驗，模擬乳桿菌溶源性噬菌體在腸道中豐度增加的情況。收集小鼠糞便以進行腸道菌群結構的測定，根據(jù)腸道菌群結構的變化表征乳桿菌噬菌體對腸道菌群的作用和影響。1.4.3 技術路線

3 結果與討論welG、welH、welI 和 welJ），而在干酪乳桿菌中很少發(fā)現(xiàn)與此相關的基因簇。所以本研究推測，鼠李糖乳桿菌具有這種不同于干酪乳桿菌的胞外多糖操縱基因，可能在表型上合成鼠李糖糖基相關的不同結構與種類的胞外多糖，使得菌株一定程度上抵御噬菌體的吸附，或者使噬菌體吸附位點發(fā)生了改變。
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