在現(xiàn)有的催化類型中,使用酶催化是一種既綠色環(huán)保,又方便快捷的方式。然而,造價昂貴、制備工藝復雜、不能循環(huán)使用等缺點成為了制約酶在工業(yè)生產(chǎn)中的不利因素。因此,通過將酶固定在特定載體上的方式,在保證了酶能夠重復利用的同時,又能在一定程度上提高酶的穩(wěn)定性。而生物礦化(Biomineralization)是一種新興的大分子固定化方式,與傳統(tǒng)的固定化方式不同,生物礦化法通過將蛋白、氨基酸等有機成分與無機鹽(磷酸鹽等)用共沉淀的方法連接在一起,從而制備出復雜的形狀、分層的組織、均勻的顆粒尺寸,并通常具有強度高等顯著性能�？茖W家們通過嘗試模仿生物體內(nèi)結(jié)晶過程,結(jié)合現(xiàn)代復合材料和控制礦物結(jié)晶技術(shù),探索出了以無機鹽為骨架,層層堆疊生物大分子的方式,制備出了具有花型結(jié)構(gòu)的納米顆粒--納米花(Nano-flower)。本研究主要分為兩個部分,第一部分是用磷酸鋅(Zn_3(PO_4)_2)作為載體實現(xiàn)脂肪酶(CSL)的固定化,并且詳細研究了CSL濃度、制備時間、溫度、離子強度及所固定的生物大分子種類對該納米顆粒形狀和大小的影響。確定了制備納米花的最適條件為:將硫酸鋅溶液(80 mg/mL,5 mL)滴加入CSL溶液(0.6 mg/mL,100 mL)中,在室溫(約20℃)條件下攪拌1小時,靜置溫育2小時后,所得到的為最佳狀態(tài)納米花。通過EDAX、掃描電鏡、透射電鏡、傅里葉紅外、XRD晶體衍射、元素分析方式對納米花進行了性質(zhì)表征,初步確認了我們制備的納米花中既含有Zn_3(PO_4)_2成分,又含有CSL酰胺鍵及N元素,證明了CSL確實被固定在了載體上,并且通過計算發(fā)現(xiàn)納米花中的CSL含量約為7.2%。接下來,將制備好的納米花用于催化熊果苷乙酰化,發(fā)現(xiàn)在添加的酶量相同時,納米花的催化活力(15.9±0.5 U)約為游離酶CSL(3.7±0.2 U)的4.3倍,同時熱穩(wěn)定性也有很大提高。將納米花重復使用10次后,仍能保持約95%的活力;在儲存20天后,保留約92%的活力,可見固定化之后的CSL穩(wěn)定性很高。在研究了CSL-Zn_3(PO_4)_2納米花的制備及催化之后,我們不禁想到,如果能找到一種金屬依賴性酶,那么將酶與這種金屬結(jié)合后,在達到常規(guī)固定化的效果的同時,又能夠極大地提高酶活。因此本次研究的第二部分中,我們選擇D-阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶(DPEase)作為研究對象。通過將其表達純化后,DPEase的純度達到90%以上,分子量約為40 kDa。我們研究了游離DPEase的各種理化性質(zhì),發(fā)現(xiàn)DPEase是Co~(2+)、Mn~(2+)依賴型酶,在添加100μM的Co~(2+)時酶活達到最大;最適pH為8.0,最適溫度為60℃。然而DPEase的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性較差,為了解決DPEase在加熱條件下易失活的問題,我們想到了將其用生物礦化的方法固定在載體上。鑒于DPEase是Co~(2+)依賴型酶,我們使用磷酸鈷作為無機載體,既能夠?qū)崿F(xiàn)固定化后提高DPEase的穩(wěn)定性,又能夠通過Co~(2+)對DPEase的激活作用,更進一步提高酶活力。這也是第一次通過生物礦化法實現(xiàn)DPEase在含Co~(2+)的納米載體上的固定化。通過對制備DPEase-Co_3(PO_4)_2的過程以及相關(guān)影響因素的深入研究,我們得出了結(jié)論:將2mg DPEase與磷酸鹽(pH 7.4,50.0 mM)混合,加入10.0μl CoSO_4(1.0 M),置于4℃條件下攪拌48h,所得沉淀即為最佳狀態(tài)納米花。通過對納米花進行掃描電鏡檢測、EDAX檢測、傅里葉紅外檢測、元素分析,初步鑒定了納米花中含有酰胺I和酰胺II帶(DPEase),以及Co、P元素(Co_3(PO_4)_2);通過計算發(fā)現(xiàn)納米花中固定的DPEase含量約為12%。在酶學研究上,納米花的催化活力(36.2±0.5 U/mg)約是游離酶(5.0±0.2 U/mg)的7.2倍。對于酶活的顯著提高,我們進行了詳細分析:由于DPEase是一種嚴格的Co~(2+)依賴性酶,在納米花的形成中,Co~(2+)可以結(jié)合DPEase的特定功能位點,并通過變構(gòu)效應(yīng)(Allosteric Effect)激活DPEase。此外,在固定化過程中,Co~(2+)和DPEase被擠壓在有限的空間,Co~(2+)非常靠近DPEase,大多數(shù)活性形式的DPEase可以在固定過程中被富集或―鎖定‖,從而輕松激活DPEase。這可能是DPEase-Co~(2+)納米花顯著提高酶活性的合理解釋。在本次研究中,我們使用了生物礦化方法,成功地制備出CSL-Zn_3(PO_4)_2與DPEase-Co_3(PO_4)_2納米花。該新方法將載體的制備和酶的固定化完美結(jié)合,大大簡化了固定化過程。此外,這種生物礦化方法可以在固定過程中顯著提高酶活及酶的穩(wěn)定性,這表明這種新的生物礦化方法對于酶(尤其是自身能夠被某種金屬離子激活的酶)的固定化,有著很深遠的意義。
【學位單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：Q814.2
【部分圖文】：

圖 1.2 各種形態(tài)的納米花[106]Figure 1.2 Different shapes of nanoflowers1.5 本論文的研究目的和意義在目前的催化反應(yīng)領(lǐng)域中，酶法催化是公認的快捷、高效且綠色環(huán)保的方式。而通常商品酶造價昂貴，實驗室純化的過程又比較復雜，因此我們需要高效地利用這些酶，將有限的酶價值最大化。節(jié)約成本的方式主要有一下幾個：提高酶活力；增強酶穩(wěn)定性；重復使用。那么如何能夠達到這三點要求是我們本次研究的立題依據(jù)�；谶@三點要求，我們想到了將酶固定化。傳統(tǒng)的固定化方式有許多優(yōu)點，但劣勢也同樣突出，比如：通過物理法將酶與載體結(jié)合后，結(jié)合不牢固而脫落的現(xiàn)象比較明顯；而采用化學法將酶固定化后，所用的交聯(lián)劑等會使酶的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，因而降低酶活。這個時候，一種全新的固定化酶方式進入了我們的視野：

圖 2.1. 不同 BSA 濃度所制備的 BSA-Cu3(PO4)2納米花[106]Figure 1. BSA-Cu3(PO4)2nanoflowers with different concentrations of BSA通過改變加酶量及反應(yīng)條件等來調(diào)節(jié)納米花的大小、形狀也同時成為了制備納米材料的一項新挑戰(zhàn)。經(jīng)過幾年的摸索，目前已經(jīng)合成了多種形狀及尺寸的納米材料。早在 2007 年，Tongming Shang 等人利用硫酸鋅與氫氧化鈉高溫混合，并加入適量 L-抗壞血酸，成功制備出了花狀，盤狀等形狀的納米結(jié)構(gòu)的氧化鋅材料[134]。納米大小 ZnO 作為半導體材料，容易在任何類型的基材上生長，例如單一基材水晶、玻璃、塑料、聚合物等，價格低廉和廣泛的生物相容性，多被應(yīng)用于傳感器、電極、壓敏電阻等領(lǐng)域[135-137]。

圖 2.1. 不同 BSA 濃度所制備的 BSA-Cu3(PO4)2納米花[106]Figure 1. BSA-Cu3(PO4)2nanoflowers with different concentrations of BSA通過改變加酶量及反應(yīng)條件等來調(diào)節(jié)納米花的大小、形狀也同時成為了制備材料的一項新挑戰(zhàn)。經(jīng)過幾年的摸索，目前已經(jīng)合成了多種形狀及尺寸的納料。早在 2007 年，Tongming Shang 等人利用硫酸鋅與氫氧化鈉高溫混合，入適量 L-抗壞血酸，成功制備出了花狀，盤狀等形狀的納米結(jié)構(gòu)的氧化鋅[134]。納米大小 ZnO 作為半導體材料，容易在任何類型的基材上生長，例如基材水晶、玻璃、塑料、聚合物等，價格低廉和廣泛的生物相容性，多被應(yīng)傳感器、電極、壓敏電阻等領(lǐng)域[135-137]。
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本文編號：2835545