干細(xì)胞是一類自我更新和多向分化潛能兩種特性的細(xì)胞群,這些特征決定了其在醫(yī)學(xué)治療和器官再生方面具有非常廣闊的應(yīng)用前景。生殖干細(xì)胞(Germline Stem Cells,GSC)分裂與分化命運決定方面的研究,已成為干細(xì)胞與發(fā)育生物學(xué)領(lǐng)域關(guān)注的熱點。自摩爾根發(fā)現(xiàn)基因的連鎖互換定律以來,果蠅(Drosophila melanogaster)一直作為遺傳學(xué)和發(fā)育生物學(xué)研究領(lǐng)域重要的模式生物。因具有可靠的干細(xì)胞標(biāo)記和清晰的發(fā)育譜系等優(yōu)點,果蠅卵巢GSC常被作為生殖干細(xì)胞研究的優(yōu)良模型。核纖層蛋白(Lamin)作為一類中間纖維(Intermediate filament,IF)蛋白為細(xì)胞核膜提供骨架支撐,同時還參與染色質(zhì)組織、DNA復(fù)制和損傷修復(fù)等過程。我們前期的工作發(fā)現(xiàn),與野生型果蠅(oregon)相比,隨著時間的推移,lamin基因突變體果蠅卵巢GSC的數(shù)量有降低的趨勢。為了確證上述結(jié)果,進(jìn)一步探究lamin調(diào)控果蠅卵巢GSC命運的機(jī)制,我們利用免疫熒光染色、有絲分裂重組和果蠅轉(zhuǎn)基因等技術(shù),研究了lamin基因調(diào)控果蠅卵巢GSC命運的初步機(jī)制,本研究成果將貢獻(xiàn)于干細(xì)胞分裂分化調(diào)控領(lǐng)域。首先,以野生型果蠅為對照,利用免疫熒光染色技術(shù)統(tǒng)計分析了lamin突變體果蠅卵巢GSC在羽化后不同天數(shù)的數(shù)量變化情況。果蠅卵巢頂端被稱為原卵區(qū),正常原卵區(qū)一般含有2-3個GSC。結(jié)果顯示:野生型果蠅羽化后第1天(1d)和第14天(14d)正常原卵區(qū)的比例分別為97.7%和96.4%,兩周內(nèi)卵巢GSC數(shù)量基本無變化。lamin四組突變體(lam ~(A25)/lam~(A25)、lam~(A25)/lam~(K2)、lam~(A25)/lam~(04643)和lam ~(K2)/lam~(04643))果蠅在羽化后第1d正常原卵區(qū)的比例分別為78.7%、81.8%、84.8%和88.0%;羽化后第14d分別降至27.9%、36.2%、37.6%和48.1%,表明卵巢GSC發(fā)生了顯著的丟失,且lam~(A25)/lam~(A25)突變體果蠅卵巢GSC丟失最嚴(yán)重。上述結(jié)果表明lamin基因是果蠅卵巢GSC維持所必需的。其次,利用UAS/gal4系統(tǒng)對lamin基因分別實施內(nèi)源性和外源性RNA干擾(RNA interfering,RNAi),統(tǒng)計羽化后不同天數(shù)(1d、7d和14d)果蠅卵巢GSC數(shù)量變化。在內(nèi)源性RNAi試驗中有兩個敲低組,分別為lamin基因2號和3號染色體敲低組。結(jié)果顯示:對照組(未敲低親本組)果蠅正常原卵區(qū)比例在兩周內(nèi)都高達(dá)92.0%以上,表明卵巢GSC數(shù)量基本沒有變化。羽化后1d、7d和14d,lamin基因2號敲低組正常原卵區(qū)比例分別為84.1%、36.7%和31.2%;3號敲低組正常原卵區(qū)的比例分別為72.1%、54.8%和36.6%。兩組RNAi試驗結(jié)果顯示:隨著時間推移,內(nèi)源性敲低lamin導(dǎo)致正常原卵區(qū)的比例明顯降低,暗示其卵巢GSC數(shù)量發(fā)生了嚴(yán)重的下降。當(dāng)外源性敲低lamin基因,實驗組統(tǒng)計結(jié)果與對照組無明顯變化(P0.05),表明外源性敲低lamin不影響GSC維持。另外,采用有絲分裂重組技術(shù)內(nèi)源性誘導(dǎo)GSC克隆,分別統(tǒng)計1d、7d和14d標(biāo)記GSC克隆的數(shù)量變化。結(jié)果顯示:野生型對照組標(biāo)記的GSC(基因型:FRT40A)的百分比在兩周內(nèi)從1d的43.7%下降到14d的42.1%,GSC數(shù)量基本無變化。而三個實驗組標(biāo)記的lamin突變(基因型分別為:FRT40A,lam~(A25)、FRT40A,lam~(K2)與FRT40A,lam~(04643))的GSC百分比從第1d的43.8%、45.0%和44.0%下降到第14d的15.1%、16.7%和17.3%,兩周內(nèi)分別有65.5%、62.9%和60.7%的GSC發(fā)生了丟失,支持lamin內(nèi)源性地發(fā)揮調(diào)控GSC維持的功能。上述結(jié)果均暗示lamin基因在調(diào)控果蠅卵巢GSC維持方面發(fā)揮內(nèi)源性作用。為了進(jìn)一步確證lamin基因的功能,排除遺傳背景的干擾,本課題構(gòu)建了一系列l(wèi)amin轉(zhuǎn)基因載體,分別從內(nèi)源和外源去挽救lamin基因缺失導(dǎo)致的表型。結(jié)果顯示:內(nèi)源性補(bǔ)充lamin基因能完全挽救lamin缺失的表型;僅外源性補(bǔ)充lamin基因無法挽救GSC的數(shù)量下降,表明lamin基因僅內(nèi)源性調(diào)控果蠅卵巢GSC的維持。此外,借助免疫組織化學(xué)染色技術(shù)檢測Lamin蛋白的表達(dá)模式,觀察發(fā)現(xiàn),Lamin蛋白在卵巢GSCs中表達(dá)量高,且定位于細(xì)胞核膜,暗示了該基因在GSC中發(fā)揮重要功能�？傊�,上述結(jié)果充分表明lamin基因發(fā)揮內(nèi)源性調(diào)控果蠅卵巢GSC命運的功能。為了確證lamin基因表達(dá)與GSC維持的相關(guān)性,在RNA水平上,利用熒光定量PCR(qPCR)檢測了lamin突變體與RNA干擾品系果蠅卵巢中l(wèi)amin基因的表達(dá)。結(jié)果顯示,與野生型相比,突變體和RNA干擾組中l(wèi)amin表達(dá)量都有明顯降低。在蛋白質(zhì)水平上,利用蛋白免疫印跡(Western Blot)技術(shù)檢測Lamin蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示:lamin突變體中Lamin蛋白的表達(dá)量顯著降低。此結(jié)果充分表明lamin基因表達(dá)下調(diào)是導(dǎo)致果蠅卵巢GSCs丟失的直接原因。再次,借助bamP-GFP報告系統(tǒng)研究lamin與已知BMP/Dpp-bam信號通路的關(guān)系。結(jié)果顯示,對照組中GFP陰性標(biāo)記的GSC數(shù)占97.7%,表明bam基因沉默是GSC維持所必需的。在lamin突變的背景下,三組實驗組果蠅(bamP-GFP;lam~(A25)/lam~(A25)、bamP-GFP;lam~(A25)/lam~(K2)和bamP-GFP;lam~(K2)/lam~(04643))卵巢中,分別有18.8%、30.3%和12.5%的GSC中檢測到GFP標(biāo)記的bam的表達(dá),明顯高于對照組2.3%比例。該結(jié)果表明lamin基因小部分地參與了GSC中bam基因的抑制(位于bam的上游),同時暗示了lamin基因主要位于bam的下游,或通過平行于BMP/Dpp-bam信號通路來抑制GSC的分化以維持干性。既然lamin突變導(dǎo)致GSC數(shù)量丟失,那么缺失的GSCs是否走向凋亡?為了回答此問題,利用TUNEL技術(shù)對lamin突變果蠅的卵巢GSCs進(jìn)行凋亡檢測。結(jié)果顯示,野生型果蠅卵巢GSC凋亡發(fā)生率為1.8%,兩種lamin突變體卵巢GSC凋亡發(fā)生率分別為5.1%和5.3%,表明野生型與突變體果蠅的凋亡發(fā)生率無明顯差異。此外,利用有絲分裂重組技術(shù)獲得的內(nèi)源性lamin突變GSC中也沒有發(fā)現(xiàn)增加的凋亡率。該結(jié)果暗示了lamin突變的GSC提前走向分化而導(dǎo)致丟失。我們的工作加深了對GSC命運決定機(jī)制的理解。
【學(xué)位單位】：安徽師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：Q25
【部分圖文】：

學(xué)資源（果蠅庫）種類豐富，遺傳分析手段相對成熟個果蠅庫：東京庫、美國庫和維也納庫，保存有各種、RNAi 等，其對研究 GSC 的自我更新、增殖和分化方用的技術(shù)有：轉(zhuǎn)基因技術(shù)、基因編輯技術(shù)、基因敲除因誘變技術(shù)、RNA 干擾技術(shù)等。的全基因組已經(jīng)完全釋放，基因序列高度保守，在進(jìn)哺乳動物有極相似之處，可用于功能性研究。

終發(fā)育為成熟的卵細(xì)胞排出體外，另外 15 個細(xì)胞則形成多倍體的滋養(yǎng)細(xì)胞（Nurse Cells）[10]，在大多數(shù)卵子形成過程中，卵母細(xì)胞生長和發(fā)育所需的營養(yǎng)物質(zhì)均有滋養(yǎng)細(xì)胞通過環(huán)管運輸[27]。卵巢中不同的細(xì)胞類型可通過其特有的分子標(biāo)記、形態(tài)特征和解剖位置加以區(qū)別。GSC 在卵巢中很容易被識別，在與 CpC 直接接觸的位置具有特征性融合蛋白“fusome”[28]作為分子標(biāo)記，fusome 在 GSC 中呈圓球形且位于 GSC 前端，而在 GSC 分化的 CB 中，fusome 呈圓球形定位于 CB 的后端，隨著 CB 分化為生殖系包囊，fusome 成長為分支狀的膜骨架結(jié)合蛋白“spectrosome”，主要標(biāo)記分化的包囊（cysts）。Fusome 和 spectrosome 均為生殖細(xì)胞特異性細(xì)胞器，富含大量的膜骨架蛋白，如 Hts 細(xì)胞骨架蛋白[28; 29]，可使用抗 Hts 抗體標(biāo)記定位生殖細(xì)胞，主要與有絲分裂紡錘體的一極有關(guān)[30]，且與生殖系囊腫的形成和卵母細(xì)胞的分化關(guān)系密切[31]。

導(dǎo)致 GSC 缺失的表型[69]。bam 基因作為 BMP/Dpp基因，位于 BMP 信號通路的下游，bam 是 GSC 不對的關(guān)鍵因子，對果蠅卵巢 GSC 的維持至關(guān)重要。正常的子代細(xì)胞 CB 的合成量高于 GSC[79]，主要作為關(guān)鍵CB 的分化[81]，但在 Bam 蛋白缺失的情況下，會抑制生殖系腫瘤。BMP-Dpp 信號通路的主要靶點是對 b夠負(fù)反饋調(diào)節(jié) bam 在 GSC 的表達(dá)水平[80]，維持 GS信號的情況下，Bam蛋白水平在過度增殖的生殖細(xì)胞中MP-Dpp 信號通路還具有逆分化的功能，可將 GSC 分能性的 GSC[87]。

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2 ;Lamins and their genes[J];Progress in Natural Science;2002年08期

3 ;A New Reformatsky Type Reaction Via Cadmium Salt In Aqueous Media[J];Chinese Chemical Letters;1999年09期

4 馬玉清;楊柳;;核纖層蛋白及相關(guān)疾病研究進(jìn)展[J];山東醫(yī)藥;2017年22期

5 WEI Wenqiang;HU Zichao;KANG Xiaonan;WANG Xuan;WANG Hongju;JI Shaoping;;Pseudo Rabies Virus Protein UL34 Interacted with UL31 to Disrupt the Human Lamin A[J];Wuhan University Journal of Natural Sciences;2018年05期

6 陳萬群,文建凡;核纖層蛋白及其基因的研究[J];自然科學(xué)進(jìn)展;2002年07期

7 ;Assembly of lamins in vitro[J];Cell Research;1996年01期

8 曾叢梅,王平;Association of lamin A/C with chromosomes in the mitosis of mouse thymus T lymphocytes[J];Chinese Science Bulletin;1995年22期

9 修木;;Wilsonart旗下的Arborite公司收購Lamin-Art公司[J];國際木業(yè);2016年06期

10 秦松;TRANSPOSABLE GENETIC ELEMENTS IN SPIRULINA AND POTENTIAL APPLICATIONS FOR GENETIC ENGINEERING[J];Chinese Journal of Oceanology and Limnology;1998年S1期

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1 閔光偉;佟向軍;陳彬;劉忠范;丁明孝;翟中和;;應(yīng)用掃描隧道顯微鏡研究核纖層蛋白分子的裝配[A];第八次全國電子顯微學(xué)會議論文摘要集（Ⅰ）[C];1994年

2 ;Over expression of Kiotho (KL) gene in fibroblast cell line of Hutchinson-Gilford progeria syndrome (HGPS) does not rescue the phenotypes of HGPS cells[A];中國優(yōu)生優(yōu)育協(xié)會第四屆全國學(xué)術(shù)論文報告會暨基因科學(xué)高峰論壇論文專輯[C];2008年

3 劉新光;;Screening and Identification of Proteins Interacting with Prelamin A[A];第二屆全國“跨學(xué)科蛋白質(zhì)研究”學(xué)術(shù)討論會論文集[C];2008年

4 ;Proteomic Study of Hutchinson-Gilford Progeria Syndrome (HGPS):Observation of pathogenic abnormality of Calcium retention in progeria fibroblasts[A];中國優(yōu)生優(yōu)育協(xié)會第四屆全國學(xué)術(shù)論文報告會暨基因科學(xué)高峰論壇論文專輯[C];2008年

5 高德俊;范巍巍;單秀梅;常爽;姜楠;張進(jìn);馬端;毛佐華;;弓形蟲棒狀體蛋白ROP16與Lamin B1相互作用及功能研究[A];中華醫(yī)學(xué)會第十五次全國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)學(xué)術(shù)會議暨中國醫(yī)師協(xié)會醫(yī)學(xué)遺傳醫(yī)師分會第一屆全國學(xué)術(shù)會議暨2016年浙江省醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)年會論文匯編[C];2016年

6 ;Aggregation of lamin A/C or progerin in fibroblasts derived from Hutchinson-Giiford progeria syndrome (HGPS) is not resulted from interaction between progerin and the promoter of LMNA gene[A];中國優(yōu)生優(yōu)育協(xié)會第四屆全國學(xué)術(shù)論文報告會暨基因科學(xué)高峰論壇論文專輯[C];2008年

7 王慧珍;崔京濤;王曉虹;王永潮;;中國紅斑狼瘡患其血清中抗Lamin抗體的研究[A];中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)會第五次會議論文摘要匯編[C];1992年

8 邢苗;劉士德;張建華;歐陽秋玲;周卓龍;康康;;多頭絨泡菌SRPK類似蛋白cDNA的分離及其功能的初步研究[A];中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)會2005年學(xué)術(shù)大會、青年學(xué)術(shù)研討會論文摘要集[C];2005年

9 劉玲玲;孫警輝;宋關(guān)斌;;OPN促BMSCs遷移過程中核力學(xué)特性變化及分子機(jī)理[A];第十二屆全國生物力學(xué)學(xué)術(shù)會議暨第十四屆全國生物流變學(xué)學(xué)術(shù)會議會議論文摘要匯編[C];2018年

10 謝永華;譚春燕;劉峰;蔣宇揚(yáng);;一種caspase蛋白新型熒光分析方法的建立[A];第六屆全國化學(xué)生物學(xué)學(xué)術(shù)會議論文摘要集[C];2009年

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本文編號：2831627