發(fā)布時間：2020-09-30 20:11

　　 生育期(特別是開花期)是影響大豆品種分布和產(chǎn)量的重要因素之一,大豆生育期調(diào)控基因的挖掘和研究,對選育生態(tài)適應性廣的優(yōu)良大豆品種至關重要。迄今,諸多調(diào)控大豆生育期的E系列基因已被克隆,它們的應用提高了育種效率和產(chǎn)量,但仍未完全解決育種問題。因此,本試驗旨在圖位克隆新的生育期基因,并進行功能分析,進一步為大豆適應性和產(chǎn)量的提高提供理論依據(jù)。具體研究內(nèi)容如下:1.利用Minsoy(Ele2e3E4)和Archer(elase2E3E4)雜交后構建的MA重組自交系進行長日照條件下開花期QTL檢測。通過親本重測序和MA群體SLAF-seq,共開發(fā)了 5,074個分子標記,構建出總長度為3,588.94cM的高密度遺傳圖譜。結合F6代和F8代MA群體的花期表型,檢測到三個穩(wěn)定遺傳的花期QTL(TOF5、TOF6.和和TOF7),分別位于5號、6號和7號染色體上。其中TOF61與E1基因所在基因組位點重合,且E1在本群體中有分離,故TOF6.1可能是E1基因。TOF7對花期貢獻率僅次于TOF6.1,其編碼基因未見報道。所以,TOF7是一個新花期位點。2.利用MA群體的7號染色體遺傳圖譜和兩年的花期數(shù)據(jù),將TOF7粗定位在Chr7:3904858和Chr7:4936114之間,約1.03Mb內(nèi),并篩選到該區(qū)間的剩余片段雜合系(Residual heterozygous lines,RHLs),#13 和#131。通過對 RHLs#13和#131的花期和生育期鑒定,這2個家系F2后代均呈現(xiàn)出3:1的分離比例,且F3后代均符合1:2:1的分離比,表明TOF7位點由單基因控制。利用TOF7位點的近等基因系(Near-isogenic lines,NILs),NIL-TOF7 植株比 NIL-tof7 的花期和生育期明顯提前,說明TOF7基因控制早花早熟。進一步精細定位,TOF7位點縮小到約138kb區(qū)間內(nèi),并鑒定到TOF7的候選基因為一個擬南芥光周期調(diào)控開花途徑中關鍵生物鐘基因的同源基因。3.通過基因序列分析,TOF7基因CDS區(qū)在親本間存在非同義堿基差異,且該堿基變異使編碼蛋白N端核定信號區(qū)的第9位氨基酸發(fā)生置換。進而對目的蛋白進行亞細胞定位,親本Minsoy中TOF7蛋白主要定位于細胞核中;而親本Archer中tof7蛋白則定位于細胞質(zhì)和細胞核中。擬南芥功能互補實驗顯示,親本Minsoy中的TOF7可回補擬南芥同源基因突變體的早花早熟表型,而親本Archer中的候選基因則不能。利用CRISPR-cas9基因編輯技術,將TOF7基因堿基缺失突變后,與野生型植株(Wild-Type,WT)相比,長日照條件下突變體明顯推遲開花5-6天,生育期延長約15天。這些結果充分證明了 TOF7基因的非同義突變導致蛋白亞細胞定位變化而形成晚花和晚熟。此外,NIL-tof7和突變株tof7分別比NIL-TOF7和WT的單株產(chǎn)量高,這說明TOF7對育種的重要性。4.TOF7基因呈現(xiàn)24h生物鐘節(jié)律表達,且主要在大豆三重復葉中表達。在大豆光周期調(diào)控花期的信號途徑中,TOF7基因通過抑制El基因的表達,進而上調(diào)GmFT2a和GmFT5a基因的表達,致使開花提前。這些結果將補充大豆生物鐘基因調(diào)控開花方面的研究。綜上所述,本研究是以QTL定位為基礎,圖位克隆到一個新的、主要的花期調(diào)控基因TOF7。通過亞細胞定位、功能互補及突變體等多種方法,證明了TOF7控制早花早熟,并參與到大豆E1-E4構成的生育期調(diào)控網(wǎng)絡中。本研究將促進大豆光周期調(diào)控生育期途徑的深入認知,為大豆品種的適應性和分子育種提供有力的理論依據(jù)。
【學位單位】：中國科學院大學(中國科學院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所)
【學位級別】：博士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：S565.1;Q943.2
【部分圖文】：

邐大豆生育期基因ｒ0ｆ７的圖位克隆與功能分析邐逡逑有Ｇ／（Ｇ／Ｇ＾ＭＥＬ４）基因等，詳細敘述見下。生物節(jié)律的控制基于一種轉錄和翻譯逡逑的負反饋機制，一些蛋白可以拮抗轉錄因子的活性，進而下調(diào)自身的表達（Ｈａｒｍｅｒ逡逑ａｎｄ邋Ｋａｙ，邋２００５）邋0逡逑ｍｏｒｎｉｎｇ邐？ｗａｎｉｎｇ逡逑￣￣￣

１．２．３．３大豆花期調(diào)控網(wǎng)絡的初步研究逡逑隨著大豆生育期關鍵基因的克隆及功能的逐步驗證，大豆光周期調(diào)控生育期逡逑的分子機制也得到進一步的明確，見圖１．２。逡逑Ｅ３邋Ｅ４逡逑ｂｉ邐邐（ｔｎ￣邋￡１逡逑！邐Ｊ逡逑NN逡逑個邋ＦＴ２＿邋卜邋＜邋ＦＴ５ａ邐ＦＴ２ａ邋少，ＦＴ５ａ，邋｜逡逑Ｉ邐Ｉ逡逑Ｅａｒｌｙ邋ｆｌｏｗｅｒｉｎｇ邐Ｌａｔｅ邋ｆｌｏｗｅｒｉｎｇ逡逑Ｌｏｗ邋ｇｒａｉｎ邋ｙｉｅｌｄ邐Ｈｉｇｈ邋ｇｒａｉｎ邋ｙｉｅｌｄ逡逑ｌ邐ｌ逡逑圖１．２大豆開花調(diào)控網(wǎng)絡逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．２邋Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ邋ｎｅｔｗｏｒｋ邋ｆｏｒ邋ｆｌｏｗｅｒｉｎｇ邋ｉｎ邋ｓｏｙｂｅａｎ逡逑大豆生育期基因五３和五４基因分別編碼光敏色素基因Ｐ／／Ｚ４３和尸／／Ｚ４２，是逡逑控制大豆光周期開花和光周期敏感性的主要基因。五３和五４基因調(diào)控大豆開花是逡逑通過誘導五７表達，進而抑制Ｆｒ（ＧｍＦ７２ａ和ＧｍＦｒｋ）的轉錄，從而抑制開花逡逑（Ｋｏｎｇ等，２０１０）。在短日照條件下，？／基因表達受到光敏色素蛋白Ｅ３和Ｅ４的誘逡逑導調(diào)控，？／基因受到五３說的抑制表達。Ｊ蛋白能夠與五／基因啟動子的ＬＵＸ元逡逑１０逡逑

行３＇端加Ａ處理、連接Ｄｕａｌ－ｉｎｄｅｘ測序接頭、ＰＣＲ擴增、純化、混樣、切膠選逡逑取目的片段，文庫質(zhì)檢合格后用ＩｌｌｕｍｉｎａＨｉＳｅｑ測序平臺進行ＰＥ１２５ｂｐ測序。逡逑具體實驗流程如圖２．１所示：逡逑Ｇｅｎｏｍｅ邐ｓｉｚｅ邐ｓ逡逑？邐ｓｄｅｄｉｏｎ邋三—三{逡逑具邐Ｉ—邋ｃｍ逡逑%煎危劍義希模椋紓澹螅簦椋錚鑠義希劍健義希粒簦幔椋歟椋睿玨鍚姡哄危海海駑義希眨梗幔�，ｅP�、？燃偓ｌ}0咖＾逡逑？邐＝＾丨４叫ｓ逡逑＞Ｃｌ２Ｚ逡逑圖２．１邋ＳＬＡＦ實驗流程逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２．１邋Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ邋ｐｒｏｔｏｃａｌ邋ｏｆ邋ＳＬＡＦ逡逑２．１．４．３分子標記的開發(fā)逡逑ＳＬＡＦ－ｓｅｑ文庫的測序原始測序讀長為ＰＥ１２５ｂｐ。為保證信息分析質(zhì)量，在逡逑分析前會對原始測序的數(shù)據(jù)進行過濾，原始數(shù)據(jù)過濾標準如下：逡逑（１）

【參考文獻】

相關期刊論文 前2條

1 蓋鈞鎰,汪越勝;中國大豆品種生態(tài)區(qū)域劃分的研究[J];中國農(nóng)業(yè)科學;2001年02期

2 任全興,蓋鈞鎰,馬育華;我國大豆品種生育期生態(tài)特性研究[J];中國農(nóng)業(yè)科學;1987年05期

本文編號：2831329