發(fā)布時(shí)間：2020-09-28 17:09

　　 近年來,草場(chǎng)退化現(xiàn)象不斷加劇,嚴(yán)重影響了生態(tài)平衡和可持續(xù)發(fā)展,而黃花棘豆作為主要的草原毒害草之一,由于其自身極強(qiáng)的抗逆性和適應(yīng)性而廣泛蔓延。本課題前期對(duì)黃花棘豆在3種逆境脅迫(ABA,NaCl和PEG)處理下的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析顯示ABF2類轉(zhuǎn)錄因子可能參與黃花棘豆的抗逆反應(yīng),但其調(diào)控機(jī)理仍不清楚。因此,本研究以前期工作為基礎(chǔ),以黃花棘豆轉(zhuǎn)錄因子OoABF2為切入點(diǎn),對(duì)其上游互作進(jìn)行蛋白篩選與鑒定,為探明黃花棘豆抗逆性的分子機(jī)制提供理論依據(jù)。(1)本研究以O(shè)oABF2轉(zhuǎn)錄因子(accession number:KU877410.1)為切入點(diǎn),結(jié)合課題組已有研究工作和國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道,首先確定SnRK2s蛋白激酶家族為目標(biāo)基因,隨后成功克隆出黃花棘豆中的所有8個(gè)SnRK2s激酶家族:暫時(shí)命名為OoSnRK2.1-OoSnRK2.8(accession number:MH636330-MH636337)。(2)通過T4 DNA連接酶分別將OoABF2和pGADT7連接,將OoSnRK2s與pGBKT7連接,構(gòu)建真核重組質(zhì)粒,利用酵母雙雜交技術(shù),在酵母細(xì)胞體內(nèi)篩選鑒定出了與OoABF2轉(zhuǎn)錄因子相互作用的SnRK2激酶蛋白為OoSnRK2.1和OoSnRK2.6。(3)構(gòu)建OoSnRK2.1-pSPYNE、OoSnRK2.6-pSPYNE和OoABF2-pSPYCE重組質(zhì)粒,利用雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù),在煙草表皮細(xì)胞內(nèi)再次體內(nèi)驗(yàn)證了OoABF2轉(zhuǎn)錄因子與OoSnRK2.1和OoSnRK2.6存在相互關(guān)系,且相互作用位點(diǎn)都在細(xì)胞核。(4)將OoSnRK2.1和OoSnRK2.6分別與pGEX-4T-1連接,將OoABF2和pET-32a連接,通過原核誘導(dǎo)表達(dá)出3個(gè)可溶性的目標(biāo)蛋白,通過Pull-Down技術(shù)在體外進(jìn)一步確證了OoABF2轉(zhuǎn)錄因子與OoSnRK2.1和OoSnRK2.6為互作蛋白。(5)綜合利用各種生物信息學(xué)方法對(duì)OoSnRK2.1和OoSnRK2.6基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析,解析了這兩個(gè)蛋白的基本理化性質(zhì),結(jié)果表明目標(biāo)蛋白都是親水性蛋白,都沒有跨膜結(jié)構(gòu)域和信號(hào)肽,都是核定位蛋白,都包括特定的保守結(jié)構(gòu)域,都含有磷酸化位點(diǎn)。通過構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)OoSnRK2.1蛋白與蒺藜苜蓿(XP 003615157.1)以及鷹嘴豆(XP 004490378.1)蛋白的一致性最高;OoSnRK2.6蛋白也與蒺藜苜蓿(XP013456889.1)蛋白序列同源性最高。(6)在3種不利脅迫(ABA,NaCl和PEG)處理下,運(yùn)用qRT-PCR技術(shù)對(duì)目標(biāo)基因OoSnRK2.1和OoSnRK2.6進(jìn)行表達(dá)譜分析,結(jié)果表明:兩者都能夠由ABA激活,并且同時(shí)在3 h處達(dá)到較高的轉(zhuǎn)錄水平,在NaCl和PEG的處理下,OoSnRK2.1和OoSnRK2.6也能夠被誘導(dǎo)表達(dá),結(jié)果表明二者可能主要通過依賴ABA信號(hào)途徑參與抗逆反應(yīng)。綜上所述,本研究表明黃花棘豆OoABF2轉(zhuǎn)錄因子和其上游的OoSnRK2.1/OoSnRK2.6激酶家族通過依賴于ABA的信號(hào)通路在逆境脅迫中發(fā)揮了重要的作用,對(duì)于揭示和闡明黃花棘豆抗逆機(jī)制具有重要的意義。
【學(xué)位單位】：西北大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：Q943.2;S812.6
【部分圖文】：

西北大學(xué)碩士專業(yè)學(xué)位論文路可簡單概括為 PYR/PYL/RCARs→PP2C→SnRKs→AREB/AB。水分脅迫下 AREB/ABF 作為核心組分參與的 ABA 依賴性途徑 PP2Cs 與 SnRKs 結(jié)合使其去磷酸化，SnRKs 激酶失活，最終 A斷；受脅迫時(shí)，植物體內(nèi) ABA 含量上升，能夠與受體結(jié)合成復(fù)合2Cs 對(duì) SnRKs 的抑制作用，從而激活 SnRKs 激酶。SnRKs 以磷酸游 AREB/ABF，進(jìn)而激活 ABA 信號(hào)途徑，誘導(dǎo)相關(guān)靶基因表達(dá)[

分析豆總 RNA 樣品質(zhì)量檢測(cè)RNzol 法，按照方法 2.2.3 的方法提取黃花棘豆總 RNA，利用 Nan結(jié)果顯示，OD260/280值分布在 1.8-2.1 區(qū)間，OD260/230在 2 以上，/μl（如表 2.5），以上結(jié)果均說明植物總 RNA 濃度和純度較高。瓊顯示，28S 條帶亮度最高，5S 條帶亮度極弱（如圖 2.1），這些結(jié)果 RNA 沒有降解和污染，純度高，完整性好，完全可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)表 2.5 黃花棘豆總 RNA 檢測(cè)數(shù)據(jù)Tab.2.5 Total RNA data of the O. ochrocephala 濃度（ng/μl） OD260/280OD260/21114.41 2.08 2.01902.50 2.05 2.07631.69 1.86 2.16

西北大學(xué)碩士專業(yè)學(xué)位論文Fig.2.1 Figure of O. ochrocephala total RNA agarose electrophoresis附注：M: DL2000（bp）；樣品 1、2、3 為所提取 RNA 的 3 個(gè)生物學(xué)平行重復(fù)3.2 蛋白間相互作用預(yù)測(cè)分析利用在線軟件，利用生物信息學(xué)的方法預(yù)測(cè) OoABF2 轉(zhuǎn)錄因子與 OoSnRK2s 蛋是否存在相互作用，預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，黃花棘豆 OoSnRK2s 與擬南芥氣孔開放因子ST1（AtSnRK2.6）有較高的一致性，黃花棘豆 OoABF2 與擬南芥 ABF2 蛋白也有高的一致性，而 OST1 與 ABF2 已被證實(shí)存在相互作用（如圖 2.2），這為研究黃花豆目標(biāo)蛋白的互作關(guān)系提供了有力的理論依據(jù)。

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 史玉俊;;黃花棘豆中的4個(gè)皂甙[J];中草藥;1993年09期

2 霍彩林;誤食黃花棘豆引起中毒2例報(bào)告[J];青海醫(yī)藥雜志;1998年12期

3 馬占鴻，趙楨梅，任青峰;黃花棘豆（毒草）的兩種新病害[J];寧夏農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào);1994年03期

4 張守信,曹光榮,李紹軍,王新來,蒲萬雄;黃花棘豆提取物對(duì)小白鼠肉瘤的抑制試驗(yàn)[J];中國獸醫(yī)科技;1991年02期

5 馬占鴻,田乃祥,趙楨梅;毒草黃花棘豆上新發(fā)現(xiàn)的兩種病害[J];植物保護(hù);1991年03期

6 馬駿生;杜玉寧;陳義中;楊瑞全;賈富琴;汪洋;;黃花棘豆化學(xué)防除技術(shù)研究[J];寧夏農(nóng)林科技;1991年06期

7 陳義忠;楊發(fā)林;;黃花棘豆的防除和利用[J];草與畜雜志;1993年03期

8 陶定章,李仲珊;寧夏南華山馬場(chǎng)家畜黃花棘豆中毒的調(diào)查[J];中國獸醫(yī)科技;1986年04期

9 曹光榮,李紹君,段得賢,劉乃利,馬雙民,黨軍海,周志明,陳義忠,王定國,黑正祥,史長君;黃花棘豆有毒成分的分析[J];中國獸醫(yī)科技;1988年03期

10 孫榮奇,賈忠建,朱子清;小花棘豆的化學(xué)成分[J];科學(xué)通報(bào);1988年08期

相關(guān)會(huì)議論文 前9條

1 楊震發(fā);沈慧敏;楊順義;;黃花棘豆活性物質(zhì)分離鑒定及抑菌活性研究[A];中國第六屆植物化感作用學(xué)術(shù)研討會(huì)論文摘要集[C];2013年

2 沈慧敏;鄧建梅;董強(qiáng);楊順義;;甘肅天然草地有毒植物黃花棘豆(Oxytropis ochrocephala)化感作用研究[A];中國第四屆植物化感作用學(xué)術(shù)研討會(huì)論文摘要集[C];2009年

3 楊友鋒;馮世蘭;傅艷萍;尉亞輝;;黃花棘豆OoLEA3蛋白的分析與鑒定[A];陜西省毒理學(xué)會(huì)防控毒物危害與優(yōu)化生態(tài)環(huán)境研討會(huì)論文集[C];2019年

4 沈慧敏;;天然草地有毒植物黃花棘豆化感作用機(jī)理研究[A];中國第五屆植物化感作用學(xué)術(shù)研討會(huì)論文摘要集[C];2011年

5 管慧銳;劉新;尉亞輝;;黃花棘豆Alternaria Sect.Undifilum菌株對(duì)擬南芥的促生機(jī)制[A];陜西省毒理學(xué)會(huì)防控毒物危害與優(yōu)化生態(tài)環(huán)境研討會(huì)論文集[C];2019年

6 楊友鋒;牛斐;傅艷萍;尉亞輝;;黃花棘豆OoABF2與OoSnRK2s蛋白互作研究[A];陜西省毒理學(xué)會(huì)防控毒物危害與優(yōu)化生態(tài)環(huán)境研討會(huì)論文集[C];2019年

7 ;附錄一:段得賢教授培養(yǎng)的研究生一覽表[A];毒理學(xué)史研究文集（第十集）[C];2012年

8 莊卉卉;尉亞輝;;黃花棘豆逆境轉(zhuǎn)錄組建立及分析[A];陜西省毒理學(xué)會(huì)2014年學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2014年

9 尉亞輝;趙寶玉;達(dá)能太;武菊英;魏朔南;何瑋;莊卉卉;郭麗珠;;草原主要毒害草研究策略與進(jìn)展[A];2015中國草原論壇論文集[C];2015年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前1條

1 本報(bào)記者 周學(xué)明;鑄就精品闖市場(chǎng)[N];張掖日?qǐng)?bào);2008年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前3條

1 莊卉卉;黃花棘豆響應(yīng)非生物脅迫轉(zhuǎn)錄組分析及干旱脅迫信號(hào)通路的研究[D];西北大學(xué);2016年

2 徐琳;祁連山箭葉錦雞兒及黃花棘豆根瘤內(nèi)生細(xì)菌多樣性與系統(tǒng)發(fā)育研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2013年

3 孫小妹;N、P添加引起亞高寒草甸群落物種多樣性喪失的機(jī)制[D];蘭州大學(xué);2015年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 牛斐;黃花棘豆抗逆轉(zhuǎn)錄因子OoABF2互作蛋白的篩選與鑒定[D];西北大學(xué);2019年

2 馮世蘭;黃花棘豆LEA3蛋白的鑒定及功能驗(yàn)證[D];西北大學(xué);2018年

3 郭琳微;黃花棘豆的遺傳結(jié)構(gòu)及苦馬豆素和內(nèi)生菌的關(guān)系研究[D];西北大學(xué);2017年

4 管慧銳;黃花棘豆抗逆轉(zhuǎn)錄因子OoNAC72的克隆及功能初步分析[D];西北大學(xué);2017年

5 韓夢(mèng)莎;一株祁連山黃花棘豆內(nèi)生芽孢桿菌新種的鑒定[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2013年

6 馬蘭波;黃花棘豆苦馬豆素與其內(nèi)生真菌關(guān)系的研究[D];青海大學(xué);2014年

7 孫英;放牧對(duì)高寒草甸4種優(yōu)勢(shì)植物光響應(yīng)和熒光特性的影響[D];甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

8 湯濤;黃花棘豆銹病及可利用性研究[D];青海大學(xué);2007年

9 鄧建梅;天祝天然草地主要有毒植物資源調(diào)查及黃花棘豆化感作用研究[D];甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué);2009年

10 樊鵬輝;黃花棘豆的種子休眠破除及化感作用研究[D];西北大學(xué);2014年

本文編號(hào)：2829037