鹽地堿蓬(Suaeda salsa L.)是一種具有高耐鹽性的真鹽生植物,在潮間帶和內(nèi)陸生境中長勢良好,但其生長環(huán)境中特別是潮間帶生境土壤中的NO_3~-含量非常低,但目前尚不清楚這兩種生境的鹽地堿蓬是如何適應(yīng)低氮環(huán)境的。本文探究了兩種生境鹽地堿蓬對低氮環(huán)境適應(yīng)的生理及分子機制。結(jié)果如下:1.N饑餓對鹽地堿蓬NO_3~-由源到庫再利用的影響將兩種生境鹽地堿蓬在200 mM NaCl條件下用1 mM NO_3~--N預培養(yǎng)。然后將幼苗用1 mM NO_3~--N和無N溶液(N饑餓)一起培養(yǎng)14天后,測定與NO_3~-再利用相關(guān)基因的表達、NO_3~-和葉綠素含量、凈光合速率以及生物量。結(jié)果表明,N饑餓處理后,與內(nèi)陸生境相比,潮間帶生境鹽地堿蓬SsNRT1.7在老葉和成熟葉中的表達顯著上調(diào),但在幼葉中并非如此。并且潮間帶生境NO_3~-和葉綠素含量、幼葉凈光合速率和地上部干重的下降幅度均低于內(nèi)陸生境。因此,與N饑餓處理后的內(nèi)陸生境相比,SsNRT1.7可能在潮間帶生境的老葉或成熟葉的NO_3~-再活化過程中發(fā)揮了更重要的作用。因此,在低氮環(huán)境中,相比于內(nèi)陸生境,潮間帶生境幼葉中更多的NO_3~-能夠更好地維持光合作用。2.鹽地堿蓬NO_3~-再利用相關(guān)基因SsNRT1.7的全長克隆根據(jù)鹽地堿蓬轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果得到的NO_3~-再利用相關(guān)基因NRT1.7信息,克隆得到中間序列(暫命名為SsNRT1.7),將該序列進行blast比對分析,結(jié)果顯示該序列與甜菜的NRT1/PTR FAMILY2.12蛋白的相似度為81%。以該序列為基礎(chǔ)通過3'RACE和5'RACE技術(shù)擴增得到SsNRT1.7基因的全長2375 bp,CDS區(qū)1851 bp。編碼區(qū)與擬南芥AtNRT1.7編碼區(qū)的同源性為55.83%。3.鹽地堿蓬SsNRT1.7的生物信息學分析及亞細胞定位SsNRT1.7編碼617個氨基酸。對該蛋白進行理化性質(zhì)分析,該蛋白為疏水穩(wěn)定蛋白;將其氨基酸序列進行SMART分析,存在PTR2保守結(jié)構(gòu)域;用TMHMM軟件對蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)進行分析,該蛋白存在12個跨膜結(jié)構(gòu)域;利用MEGA軟件對該基因的蛋白序列進行系統(tǒng)進化分析,發(fā)現(xiàn)該蛋白與甜菜、菠菜、藜麥的親緣關(guān)系最近。將SsNRT1.7基因連接到表達載體pCAMBIA1300-35S-sGFP上,經(jīng)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化測序成功后,對煙草進行瞬時轉(zhuǎn)化,用雙光子激光掃描共聚焦顯微鏡觀察煙草表皮細胞內(nèi)SsNRT1.7和GFP的融合表達情況。結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)空載體pCAMBIA1300-35S-sGFP的細胞內(nèi)布滿了綠色熒光,而轉(zhuǎn)SsNRT1.7的煙草表皮細胞只有細胞膜有綠色熒光,表明SsNRT1.7定位于細胞膜。4.擬南芥AtNRT1.7突變體、SsNRT1.7轉(zhuǎn)基因純合株系的篩選我們選取SALK_022429擬南芥突變體株系,利用雙引物法進行鑒定,獲得了SALK_022429純合植株。將SsNRT1.7基因連接到表達載體pCAMBIA1300-35S-sGFP上,經(jīng)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化測序成功后,對純合突變體植株和WT植株進行花序侵染,獲得過表達和回補植株,利用潮霉素抗性篩選出陽性植株,并進行DNA水平的驗證,最終獲得純合過表達和回補株系,并根據(jù)熒光定量PCR結(jié)果篩選出表達量較高的株系。
【學位單位】：山東師范大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：Q943.2
【部分圖文】：

圖 1 擬南芥硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白的生理功能（Fan et al., 2009）Fig. 1 Physiological function of Arabidopsis nitrate transporter皮細胞吸收的 NO3-主要通過四種途徑發(fā)揮作用：（1）在根部酸或酰胺，用于維持植物體的正常生長代謝。（2）直接以 NO導管轉(zhuǎn)運至植物的其他器官而發(fā)揮作用。（3）作為儲存狀態(tài)儲界氮素營養(yǎng)不足時釋放出來維持植物體的生長。（4）重新返回organ et al., 1973）。對 NO3-的重新利用生長介質(zhì)中氮營養(yǎng)充沛時，植物會以超過其生長代謝所需的量存起來。當生長后期植物的需氮量大而吸收量難以滿足或是遭

1-1 兩種生境鹽地堿蓬葉片取材葉ple of leaf position in the plants of two利用相關(guān)基因的篩選及表O3-再利用相關(guān)基因的表達情況，O3-再利用相關(guān)的基因，然后將SsNRT1.7，下同）的保守區(qū)，用 N 饑餓處理后提取葉片總 RNA，

山東師范大學碩士學位論文處理對鹽地堿蓬 NO3-再利用相關(guān)基因表達量的影中利用熒光定量PCR分析了SsNRT1.7基因在N饑餓處理化。結(jié)果顯示，在潮間帶生境中，與對照相比（1 mM NO3--、成熟葉和新葉中 SsNRT1.7 的表達量均出現(xiàn)了上調(diào)，尤。在內(nèi)陸生境中，N 饑餓使老葉和幼葉中的 SsNRT1.7 出有影響。N 饑餓對老葉中 SsNRT1.7 的誘導表達在潮間帶，即在潮間帶和內(nèi)陸種群中，N 饑餓植物老葉中 SsNRT1的 2.88 和 1.48 倍（圖 1-2）。

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本文編號：2821937