先天免疫對(duì)于硬骨魚類抵抗病原微生物侵染而言至關(guān)重要。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β激活激酶1(Transforming growth factor-β-activated kinase1,TAK1)是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族的成員,在NF-κB及AP-1炎癥信號(hào)通路中起著重要作用,然而TAK1在抗病毒先天免疫IRF/IFN通道中的功能尚不清楚。本論文成功克隆得到青魚(black carp,Mylopharyngodon piceus)TAK1基因的開放閱讀框(open reading frame,ORF),并對(duì)青魚TAK1(bcTAK1)在宿主細(xì)胞抗病毒先天免疫應(yīng)答中的功能進(jìn)行了研究。bcTAK1基因的開放閱讀框含1626個(gè)核苷酸,編碼541個(gè)氨基酸;ExPASy軟件預(yù)測(cè)bcTAK1分子量為75 Kda,等電點(diǎn)為7.55。bcTAK1與草魚TAK1同源性最高,達(dá)到98.5%,并且與哺乳動(dòng)物TAK1同源性也較高,在結(jié)構(gòu)進(jìn)化中保守,主要由N端的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶結(jié)構(gòu)域(S/TKc,12-260aa)和C端的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域(Coiled-coil,465-528aa)構(gòu)成。免疫印跡實(shí)驗(yàn)表明:bcTAK1基因在HEK293T細(xì)胞和EPC細(xì)胞中均能有效表達(dá),但其遷移條帶暗示bcTAK1具有糖基化修飾。免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示:bcTAK1分布于細(xì)胞質(zhì)區(qū)域,且具有呈點(diǎn)樣分布的特點(diǎn)。雙熒光素酶報(bào)告基因分析表明:bcTAK1可不同程度的下調(diào)青魚干擾素a(bcIFNa)啟動(dòng)子、斑馬魚干擾素1(DrIFNφ1)啟動(dòng)子、斑馬魚干擾素2(DrIFNφ2)啟動(dòng)子、斑馬魚干擾素3(DrIFNφ3)啟動(dòng)子和胖頭鯉魚干擾素(eIFN)啟動(dòng)子的活性。在EPC細(xì)胞中同時(shí)過表達(dá)bcTAK1和青魚干擾素調(diào)節(jié)因子7(bcIRF7)時(shí),bcTAK1可以大幅上調(diào)bcIRF7誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN的能力。細(xì)胞攻毒和噬斑實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:單獨(dú)表達(dá)bcTAK1的EPC細(xì)胞較對(duì)照組細(xì)胞而言,其抗草魚呼腸孤病毒(GCRV)和鯉春病毒血癥病毒(SVCV)能力未受影響;單獨(dú)表達(dá)bcIRF7的EPC細(xì)胞,其抗病毒能力明顯得到提升。然而同時(shí)表達(dá)bcTAK1和bcIRF7的EPC細(xì)胞比單獨(dú)表達(dá)bcIRF7的EPC細(xì)胞具備明顯增強(qiáng)的抗病毒能力。綜上所述,本論文揭示了bcTAK1在青魚抗病毒先天免疫反應(yīng)中具備正向調(diào)節(jié)bcIRF7誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN的能力的作用和正向調(diào)控bcIRF7介導(dǎo)的抗病毒活性的功能,這在脊椎動(dòng)物乃至人類中是首次發(fā)現(xiàn)。
【學(xué)位單位】：湖南師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S917.4;Q78
【部分圖文】：

26圖 3-1：bcTAK1 的 ORF 區(qū)域。bcTAK1 的 ORF 由 1626 個(gè)核苷酸組成，預(yù)測(cè) bcTAK1 的蛋白包含 541 個(gè)氨基酸。畫框的是 S/TKc 結(jié)構(gòu)域（12-260aa），陰影部分的是 Coiled-coil 結(jié)構(gòu)域 （465-528aa）。蛋白結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)是通過在線軟件 Simple Modular Architecture ResearchTool (SMART) (http://smart.embl-heidelberg.de/)數(shù)據(jù)庫(kù)。Fig. 3-1: ORF region of bcTAK1. The ORF of bcTAK1 consists of 1626 nucleotides, and theprotein predicted bcTAK1 contains 541 amino acids. The frame is the S/TKc domain (12-260aa),and the shaded part is the Coiled-coil domain (465-528aa). The protein domain is predicted by theonline software Simple Modular Architecture Research Tool (SMART)(http://smart.embl-heidelberg.de/) database.3.2 bcTAK1 的進(jìn)化史研究為了進(jìn)一步分析 TAK1 基因的進(jìn)化史，本研究將 bcTAK1 的氨基酸序列與其它物種的 TAK1 氨基酸序列進(jìn)行了比對(duì)，包含了 NCBI 上很多已知的序列（表2）。比對(duì)表的結(jié)果表明青魚的 TAK1 與果蠅的 TAK1 同源性最低，只有 43.9%，相似度也是僅有 30.4%，緊接著是與致倦庫(kù)蚊的 TAK1，同源性 46.4%，相似度

圖 3-2：脊椎動(dòng)物 TAK1 的進(jìn)化分析。使用軟件 MEGA6 和 GeneDoc 對(duì)脊椎動(dòng)物 TAK1 的氨基酸序列進(jìn)行進(jìn)化分析 （A），TAK1 序列來自以下物種：H. sapiens (AAV38460.1), M.musculus (NP_033342.1), G. gallus (XP_015140171.1)和青魚 TAK1。通過軟件 MEGA 6 構(gòu)建的進(jìn)化樹 （B），選用方法是 NJ （Neighbor Joining）鄰接法，TAK1 序列來自以下的物種：P. paniscs (XP_008974742.1), M. musculus (NP_033342.1), P. troglodytes (XP_009449928.1),R. norvegicus (NP_001101390.2), S. scrofa (APX52954.1), H. sapiens (AAV38460.1), B.taurus (NP_001075064.1), G.. gallus (XP_015140171.1), X. laevis (NP_001084359.1), P.olivaceus (AJE25832.1), E. coioiaes (AGQ48129.1), D. rerio (NP_001018586.1), C. idella(AGI51677.1), O. niloticus (XP_005475207.1), P. lividus (ABF82443.1), C. intestinalis(NP_001071829.1) and C. quinquefasciatus (XP_001848119.1)。標(biāo)尺代表著規(guī)模長(zhǎng)度，進(jìn)化樹不同分支上的數(shù)字代表建立進(jìn)化樹后，分支符合度的百分?jǐn)?shù)。Fig. 3-2: Evolution of vertebrate TAK1. (A) Comparisons of bcTAK1 with other vertebrate TAK1protein sequences by using MEGA 6.0 program and GeneDoc program, which including: H.sapiens (AAV38460.1), M. musculus (NP_033342.1), G. gallus (XP_419832.3), and M. piceus. (B)The phylogenetic tree was constructed by the software MAGE6, NJ (Neighbor Joining) methodwas selected, the TAK1 sequence is from the following species: P. paniscs (XP_008974742.1), M.musculus (NP_033342.1), P. troglodytes (XP_009449928.1), R. norvegicus ( NP_001101390.2), S.scrofa (APX52954.1), H.

為了了解 bcTAK1 蛋白的體外過表達(dá)情況，本研究構(gòu)建了能表達(dá) bcTAK1 蛋白 的 重 組 質(zhì) 粒 ， 它 們 分 別 是 pcDNA5-FRT/TO-Flag-bcTAK1 和pcDNA5-FRT/TO-bcTAK1-Flag。因?yàn)?HEK293T 細(xì)胞能夠高效表達(dá)外源基因，而EPC 細(xì)胞又可以作為很好的魚類實(shí)驗(yàn)細(xì)胞，所以選取這兩種細(xì)胞進(jìn)行真核表達(dá)實(shí)驗(yàn)。分別將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入 HEK293T 細(xì)胞和 EPC 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后 48 h 收細(xì)胞，使用全細(xì)胞裂解液進(jìn)行 Western-Blot。和預(yù)測(cè)的蛋白大小 75KDa 相比，實(shí)際采用鼠抗（Flag）檢測(cè)到的 bcTAK1 稍微大一點(diǎn)點(diǎn)，這可能是蛋白存在了一定的修飾，有趣的是，在 EPC 細(xì)胞中過表達(dá)的 bcTAK1 有很明顯的五條帶（圖 3-3-A），據(jù)此推測(cè) bcTAK1 蛋白可能存在糖基化或者磷酸化之類的修飾，因?yàn)樵?bcTAK1 的氨基酸序列中存在五個(gè)符合 N-X-S/T 公式的 N-連接的糖基化位點(diǎn)，分別為：N181、N318、N405、N425、N513。然而，在 HEK293T 細(xì)胞中這些條帶并不是太明顯，猜測(cè)可能是因?yàn)?HEK293T 細(xì)胞中蛋白表達(dá)量較大，導(dǎo)致蛋白條帶變粗，最終連在一起，看起來較模糊（圖 3-3-B）。

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 伍輝萍;楊承祥;周俊;洪彬源;何萬友;黃慧慧;;丙泊酚對(duì)小鼠急性腎缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及TAK1在其中的作用[J];廣東醫(yī)學(xué);2016年18期

2 伍輝萍;周俊;歐偉明;劉梅芳;李云;梁幸甜;楊承祥;;丙泊酚對(duì)腎小管上皮細(xì)胞系缺血再灌注損傷后纖維化和TAK1的影響[J];廣東醫(yī)學(xué);2017年20期

3 劉明龍;曾永祥;盧守燕;李建華;劉天喜;趙建雄;;復(fù)腎顆粒對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞TAK1表達(dá)的影響[J];中成藥;2011年02期

4 劉明龍;曾永祥;盧守燕;李建華;劉天喜;;復(fù)腎顆粒對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞TAK1表達(dá)的影響及其機(jī)制探討[J];中國(guó)中藥雜志;2011年18期

5 王欽富;李坤;李志;徐娜;董敏;韓慧;;靶向Tak1基因的siRNA干擾對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)[J];中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù);2011年01期

6 李錫;李苗;白希壯;;TAK1基因在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑膜組織的表達(dá)與活化研究[J];解剖科學(xué)進(jìn)展;2013年01期

7 沈勤,施建華,殷冬梅,顧建蘭,張然;TAK1在膠質(zhì)細(xì)胞iNOS表達(dá)中的作用機(jī)制[J];江蘇大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2005年04期

8 李錫;白希壯;;人TAK1基因啟動(dòng)子活性的研究[J];解剖科學(xué)進(jìn)展;2016年06期

9 劉梨;祁芳;李艷玲;艾坤;蔡雄;李鑫;張泓;;電針對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞內(nèi)TAK1表達(dá)的影響[J];湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào);2017年01期

10 肖祥彬;覃數(shù);張冬穎;馬康華;;辛伐他汀對(duì)大鼠心肌梗死后心室重構(gòu)的影響及其與TGF-β_1/TAK1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的相關(guān)性[J];解放軍醫(yī)學(xué)雜志;2009年09期

相關(guān)會(huì)議論文 前9條

1 張小小;;TAK1在三氯乙烯所致接觸性超敏反應(yīng)中的作用[A];中國(guó)毒理學(xué)會(huì)第七次全國(guó)毒理學(xué)大會(huì)暨第八屆湖北科技論壇論文集[C];2015年

2 趙飛;李言偉;潘厚軍;石存斌;李安興;吳淑勤;;草魚TRAF6和TAK1基因克隆及其在多子小瓜蟲感染時(shí)的表達(dá)分析[A];中國(guó)水產(chǎn)學(xué)會(huì)魚病專業(yè)委員會(huì)2013年學(xué)術(shù)研討會(huì)論文摘要匯編[C];2013年

3 李琴;李曉宇;劉皋林;;Inhibition of Rho-kinase ameliorates myocardial remodeling and fibrosis in pressure overload and myocardial infarction:Role of TGF-β1-TAK1[A];2013年中國(guó)臨床藥學(xué)學(xué)術(shù)年會(huì)暨第九屆臨床藥師論壇論文集[C];2013年

4 Qin Li;Yuan Xu;Xiaoyu Li;Yankun Guo;Gaolin Liu;;Inhibition of Rho-kinase ameliorates myocardial remodeling and fibrosis in pressure overload and myocardial infarction: Role of TGF-β1-TAK1[A];2013年中國(guó)藥學(xué)大會(huì)暨第十三屆中國(guó)藥師周論文集[C];2013年

5 李琴;徐媛;李曉宇;郭彥琨;劉皋林;;TGF-β1-TAK1在Rho激酶抑制劑對(duì)心肌梗死和壓力超負(fù)荷小鼠心臟重構(gòu)影響中的作用[A];第十三次全國(guó)臨床藥理學(xué)學(xué)術(shù)大會(huì)論文匯編[C];2012年

6 劉星光;姚鳴;李楠;王春梅;鄭媛媛;曹雪濤;;鈣/鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶Ⅱ通過結(jié)合并活化TAK1和IRF3加強(qiáng)巨噬細(xì)胞中TLR配體誘導(dǎo)的炎癥因子和Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生[A];第六屆全國(guó)免疫學(xué)學(xué)術(shù)大會(huì)論文集[C];2008年

7 韓超峰;陳濤涌;曹雪濤;;新型絲/蘇氨酸激酶TAO3通過結(jié)合TRAF2和TAK1調(diào)節(jié)TNFα信號(hào)通路[A];第六屆全國(guó)免疫學(xué)學(xué)術(shù)大會(huì)論文集[C];2008年

8 吳永貴;徐興欣;;TAK1對(duì)高糖與晚期糖基化產(chǎn)物培養(yǎng)的骨髓來源巨噬細(xì)胞活化的作用及機(jī)制[A];中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)腎臟疾病專業(yè)委員會(huì)2018年學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要匯編[C];2018年

9 吳永貴;徐興欣;;TAK1在糖尿病腎病巨噬細(xì)胞激活中的作用及機(jī)制研究[A];中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)腎臟疾病專業(yè)委員會(huì)2018年學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要匯編[C];2018年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前7條

1 徐興欣;TAK1在糖尿病腎病巨噬細(xì)胞激活中的作用及機(jī)制研究[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2015年

2 歐陽川;蛋白激酶A和水楊酸類藥物調(diào)控蛋白激酶TAK1激活的新型分子機(jī)制[D];浙江大學(xué);2015年

3 李波;TAK1在卵巢惡性上皮腫瘤中的表達(dá)及其對(duì)紫杉醇在SKOV3和OVCAR3細(xì)胞中的化療增敏研究[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2017年

4 李琪;TRIM8調(diào)控TNFα與IL-1β誘導(dǎo)的NF-κB激活的分子機(jī)制[D];武漢大學(xué);2012年

5 金鑫行;米非司酮對(duì)子宮巨噬細(xì)胞活化的作用及機(jī)制研究[D];浙江大學(xué);2017年

6 李小強(qiáng);動(dòng)脈粥樣硬化的新調(diào)控基因-JAZF1和KLF14[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2014年

7 顧美娣;蛋白磷酸酶PP1和RAF激酶抑制蛋白R(shí)KIP在模式識(shí)別受體信號(hào)中的調(diào)控作用及分子機(jī)制[D];浙江大學(xué);2015年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 王嬋媛;青魚TAK1基因的分子克隆及功能初探[D];湖南師范大學(xué);2019年

2 陽冉;姜黃素對(duì)神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓TAK1表達(dá)和星形膠質(zhì)細(xì)胞的影響[D];中南大學(xué);2010年

3 呂海迪;靶向TAK1基因的siRNA干擾前列腺癌DU145細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究[D];蘭州大學(xué);2014年

4 韓寧;腸道病毒71型3C蛋白酶拮抗TAK1復(fù)合體介導(dǎo)的天然免疫信號(hào)通路的機(jī)制研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2014年

5 馮世堯;TAK1信號(hào)通路在高糖誘導(dǎo)骨髓來源巨噬細(xì)胞激活中的作用[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2016年

6 盧守燕;TGF-β1/TAK1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在腎間質(zhì)纖維化中的作用及福辛普利對(duì)其影響的實(shí)驗(yàn)研究[D];蘭州大學(xué);2010年

7 許錦霞;沉默TAK1表達(dá)對(duì)三氧化二砷作用Kasumi-1細(xì)胞凋亡的研究[D];河南大學(xué);2013年

8 邵天偉;靜脈注入膽紅素對(duì)新生大鼠脾磷酸化TAK1和磷酸化IKK蛋白表達(dá)的影響[D];瀘州醫(yī)學(xué)院;2012年

9 左冠超;基于TGF-β1/TAK1信號(hào)通路觀察通心絡(luò)膠囊干預(yù)ISO致大鼠心肌纖維化的實(shí)驗(yàn)研究[D];成都中醫(yī)藥大學(xué);2016年

10 張頂頂;TAK1信號(hào)通路在創(chuàng)傷性腦損傷中的作用機(jī)制研究[D];南京大學(xué);2013年

本文編號(hào)：2821572