黃熱病毒(Yellow Fever Virus,YFV)是黃病毒科(Flavivirus)的原型病毒,能夠?qū)е曼S熱病的發(fā)生。黃熱病毒主要流行于南美洲、非洲的熱帶和亞熱帶地區(qū),據(jù)估計(jì),全球每年有80000至200000人感染黃熱病毒,其中有30000至60000人死亡。由于缺乏對(duì)YFV與宿主相互作用的分子機(jī)制及其致病性的了解,臨床上現(xiàn)階段并無(wú)有效的治療藥物。黃熱病毒-17D(YFV-17D)是黃熱病毒減毒疫苗株,被廣泛應(yīng)用于預(yù)防YFV的感染。YFV-17D與Asibi病毒株僅有0.63%的核酸序列差異以及0.94%的氨基酸序列差異。因?yàn)樗痪邆渲虏⌒?所以可以在BSL-2的實(shí)驗(yàn)室里培養(yǎng),是研究YFV的理想模型。全基因組功能喪失篩選(Genome-wide Loss-of-Function Screening)是尋找影響特定生物學(xué)行為關(guān)鍵基因的重要工具,有助于我們理解生物學(xué)行為內(nèi)在的分子機(jī)制。于基于RNA干擾技術(shù)的全基因組敲低篩選系統(tǒng)的相比,CRISPR基因敲除技術(shù)具有更高效的敲除效率,更低的脫靶效率等優(yōu)點(diǎn)。近年來(lái),基于CRISPR-Cas9技術(shù)的全基因組敲除篩選系統(tǒng)在病毒-宿主相互作用領(lǐng)域中的應(yīng)用,有助于我們發(fā)現(xiàn)調(diào)控病毒感染的宿主因子,是理解病毒感染的分子機(jī)制的重要工具和研究平臺(tái)。例如,該篩選體系的應(yīng)用在西尼羅河病毒(West Nile Virus,WNV)、登革熱病毒(Dengue Virus,DENV)等病毒的研究中發(fā)現(xiàn)了新的關(guān)鍵宿主因子,為我們理解和治療這些病毒引發(fā)的疾病提供了新的研究線索。本研究旨在建立基于CRISPR-Cas9技術(shù)的全基因組敲除篩選體系,將該系統(tǒng)應(yīng)用于YFV與宿主相互作用的研究中,以發(fā)現(xiàn)調(diào)控YFV感染的關(guān)鍵宿主因子。我們使用YFV-17D作為建立該系統(tǒng)的病毒模型,包裝出具有感染能力的完整YFV-17D疫苗株病毒。首先,我們驗(yàn)證了 YFV-17D可以在人類肝癌細(xì)胞系Huh7細(xì)胞中完成完整的生命周期,能包裝出具有感染能力的完整病毒。因?yàn)樵摷?xì)胞株能在感染YFV-17D時(shí)出現(xiàn)細(xì)胞病理效應(yīng)(Cytopathic effect,CPE),所以我們選取了 Huh7細(xì)胞作為CRISPR-Cas9全基因組敲除篩選調(diào)控YFV-17D感染的宿主因子的細(xì)胞模型。隨后,我們將CRISPR文庫(kù) GeCKO(Genome-scale CRISPRKnock-Out)文庫(kù)包裝成慢病毒文庫(kù)后轉(zhuǎn)導(dǎo)Huh7細(xì)胞,并使用YFV-17D進(jìn)行感染。感染后篩選到對(duì)YFV-17D產(chǎn)生抵抗從而存活下來(lái)的細(xì)胞群,通過(guò)對(duì)他們所攜帶的guide RNA(gRNA)進(jìn)行深度測(cè)序,以檢測(cè)這些細(xì)胞中g(shù)RNA的豐度,我們鑒定出了數(shù)個(gè)候選的正向調(diào)控YFV-17D感染的宿主因子。其中,靶向基因ZNF629的gRNA具有最多拷貝數(shù)和富集。通過(guò)建立2株攜帶靶向ZNF629基因gRNA并對(duì)YFV-17D感染產(chǎn)生高抵抗力的單克隆細(xì)胞株,我們發(fā)現(xiàn)這2株細(xì)胞上清培養(yǎng)液中釋放的YFV-17D病毒顆粒顯著減少,這些初步數(shù)據(jù)提示ZNF629可能是一個(gè)能正向調(diào)控YFV-17D感染的宿主因子。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中,我們還需要驗(yàn)證ZNF629是否為真實(shí)的正向調(diào)控YFV-17D感染的宿主因子以及對(duì)它如何調(diào)控其感染的分子機(jī)制做深入的研究。綜上所述,我們建立了基于CRISPR-Cas9技術(shù)的全基因組敲除篩選系統(tǒng),以Huh7細(xì)胞為細(xì)胞模型,應(yīng)用于黃熱病毒與宿主相互作用的研究中。我們發(fā)現(xiàn)部分Huh7細(xì)胞對(duì)YFV-17D感染產(chǎn)生抵抗并篩選到了包括ZNF629在內(nèi)的數(shù)個(gè)調(diào)控該病毒感染的候選宿主因子。本文所建立的應(yīng)用于YFV與宿主相互作用研究的篩選系統(tǒng)篩選方法簡(jiǎn)單有效,在YFV研究中有重要的應(yīng)用價(jià)值。
【學(xué)位單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R373.33
【部分圖文】：

圖１．１．邋ＹＦＶ遺傳物質(zhì)和蛋白的結(jié)構(gòu)示意圖（圖源自參考文獻(xiàn)７）。Ａ：邋ＹＦＶ未成熟病毒顆粒的逡逑冷凍電鏡示意圖。Ｂ：邋ＹＦＶ基因組ＲＮＡ。每種不同顏色代表不同的病毒蛋白，箭頭代表形成逡逑的多聚蛋白的切割位點(diǎn)。藍(lán)色箭頭代表病毒來(lái)源的蛋白酶體切割途徑。紅色或黑色箭頭表示逡逑宿主細(xì)胞來(lái)源的蛋白酶體切割途徑。Ｃ：邋ＹＦＶ翻譯形成的多聚蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上跨膜示意圖。逡逑２逡逑

邋１邋卜逡逑＂Ａｉｌ邋ｉ？Ａ邋Ａ邋／Ｖ邋Ａ邐ｊｒ＾Ｌ邋ＪＬ逡逑圖１．１．邋ＹＦＶ遺傳物質(zhì)和蛋白的結(jié)構(gòu)示意圖（圖源自參考文獻(xiàn)７）。Ａ：邋ＹＦＶ未成熟病毒顆粒的逡逑冷凍電鏡示意圖。Ｂ：邋ＹＦＶ基因組ＲＮＡ。每種不同顏色代表不同的病毒蛋白，箭頭代表形成逡逑的多聚蛋白的切割位點(diǎn)。藍(lán)色箭頭代表病毒來(lái)源的蛋白酶體切割途徑。紅色或黑色箭頭表示逡逑宿主細(xì)胞來(lái)源的蛋白酶體切割途徑。Ｃ：邋ＹＦＶ翻譯形成的多聚蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上跨膜示意圖。逡逑２逡逑

３．１邋ＹＦＶ－１７Ｄ疫苗株病毒的建立及滴度測(cè)定逡逑為了得到具備感染能力的減毒活黃熱病毒１７Ｄ邋（ＹＦＶ－１７Ｄ），我們首先通過(guò)體逡逑外轉(zhuǎn)錄線性化的具備完整ＹＦＶ－１７Ｄ基因組的ｐＡＣＮＲ－ＹＦＶ－１７Ｄ質(zhì)粒（圖３．１邋Ａ，邋Ｂ），逡逑得到了含有ＹＦＶ－１７Ｄ完整病毒基因組的ＲＮＡ邋（圖３．１Ｃ），并通過(guò)電轉(zhuǎn)的方法，將逡逑體外轉(zhuǎn)錄得到的含有完整病毒基因組的ＲＮＡ轉(zhuǎn)染到Ｈｕｈ７．５細(xì)胞株中。病毒ＲＮＡ逡逑轉(zhuǎn)染成功后，病毒基因組會(huì)在Ｈｕｈ７．５細(xì)胞株中完成自我復(fù)制和翻譯，從而包裝出逡逑具備感染能力的完整病毒顆粒。在轉(zhuǎn)染４８小時(shí)后，通過(guò)收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，并逡逑對(duì)其進(jìn)行濃縮后，分裝得到具有感染能力的ＹＦＶ－１７Ｄ病毒顆粒，并對(duì)其進(jìn)行空斑逡逑形成實(shí)驗(yàn)（圖３．１邋Ｄ），測(cè)定所得到的ＹＦＶ－１７Ｄ病毒顆粒的ＰＦＵ值為６．２５ｘ邋１０６邋ＰＦＵ／ｍｌ逡逑（圖３．１邋Ｄ），從而確定本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)行病毒感染實(shí)驗(yàn)時(shí)特定ＭＯＩ值所需要的病毒逡逑顆粒使用劑量。逡逑２４逡逑

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