發(fā)布時(shí)間：2020-09-16 12:45

　　 西洋參為五加科多年生草本植物,是世界公認(rèn)的滋補(bǔ)、藥食兩用植物。西洋參的有效成分為人參皂苷,在強(qiáng)身益智,明目,安精神,止驚悸,延年益壽等方面有著重要的作用。2,3-氧化角鯊烯作為人參皂苷生物合成的中心,分為甲羥戊酸途徑和始于丙酮酸的2-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸(MEP)的上游途徑,以及環(huán)化、羥基化、糖基化等修飾過程的下游途徑。人參屬的藥理學(xué)活性因人參皂苷的種類和含量的不同而異。糖基化是人參皂苷合成的最后一步,也是賦予人參皂苷特異性、多樣性的關(guān)鍵一步。近年來許多學(xué)者對人參皂苷合成的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因做了許多研究,但西洋參相關(guān)葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的研究還不夠充分。本文以實(shí)驗(yàn)室保存的西洋參愈傷組織為材料,用RT-PCR方法成功的獲得三個(gè)催化人參皂苷合成的UDP-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因序列,并將三個(gè)基因與真核表達(dá)載體pAUR123連接,轉(zhuǎn)化到釀酒酵母中,通過超聲波破碎后,用SDS-PAGE蛋白電泳檢測基因表達(dá)情況,再用HPLC檢測酶促反應(yīng)產(chǎn)物確定糖基轉(zhuǎn)移酶的功能,最后對發(fā)酵溫度、時(shí)間、搖瓶轉(zhuǎn)速三個(gè)條件進(jìn)行優(yōu)化培養(yǎng),具體的研究成果如下:1、糖基轉(zhuǎn)移酶基因的獲得。以有質(zhì)感、生長旺盛的西洋參愈傷組織為材料,用寶生物的全RNA提取試劑盒獲取西洋參的總RNA。用RTaseM-MLV酶催化反轉(zhuǎn)錄出西洋參的cDNA,以人參中PgUGT100、PgUGT101、PgUGT102和PgUGT103為模板設(shè)計(jì)簡并引物,以cDNA為模板成功克隆出三條序列,經(jīng)測序后分別確定三條序列均為1428bp,翻譯475個(gè)氨基酸,編碼蛋白質(zhì)大小均約為53KDa,對他們的氨基酸序列進(jìn)行序列比對和同源建模后確定得到目的序列,并命名為序列一、序列二和序列三。2、糖基轉(zhuǎn)移酶的異源表達(dá)載體構(gòu)建。將葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因序列一、序列二和序列三與pAUR123連接,構(gòu)建了pAUR123-序列一、pAUR123-序列二和pAUR123-序列三三個(gè)重組載體,之后轉(zhuǎn)化到INVSc1釀酒酵母中,經(jīng)菌落PCR和雙酶切鑒定后,成功構(gòu)建Y-pAUR123-序列一、Y-pAUR123-序列二和Y-pAUR123-序列三三個(gè)酵母工程菌。3、糖基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)情況分析。對構(gòu)建的三個(gè)工程菌分別進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng),用SDS-PAGE蛋白電泳檢測工程菌中目的蛋白表達(dá)情況,在蛋白電泳圖中三個(gè)目的蛋白的特征性條帶都在53KDa,結(jié)果表明三條序列在三個(gè)釀酒酵母工程菌中都成功表達(dá)。4、將三個(gè)重組酵母菌種破碎后的蛋白液作為粗酶液,添加人參皂苷和UDPG后做酶促反應(yīng)。用液相色譜分析酶促反應(yīng)產(chǎn)物,序列一可以催化原人參三醇生成F1,再催化F1生成Rg1,因此將序列一命名為Pq-PPT-6,20-O-UGT,并將核酸序列提交到GenBank獲得檢索號:MK641514,序列二可以催化原人參三醇生成Rh1,因此將序列二命名為Pq-PPT-6-O-UGT,并將核酸序列提交到GenBank獲得檢索號:MK641515,序列三未檢測到催化活性,因此將序列三命名為Pq-PPT-20-O-UGT,并將核酸序列提交到GenBank獲得檢索號:MK641516。5、工程菌發(fā)酵條件優(yōu)化。從發(fā)酵溫度、培養(yǎng)時(shí)間、搖瓶轉(zhuǎn)速三個(gè)方面對工程菌Y-pAUR123-Pq-PPT-6,20-O-UGT和Y-pAUR123-Pq-PPT-6-O-UGT進(jìn)行優(yōu)化培養(yǎng),確定了適宜發(fā)酵溫度為30℃,適宜發(fā)酵時(shí)間為38h,適宜搖瓶轉(zhuǎn)速為270rpm。
【學(xué)位單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：Q943.2;S567.53
【部分圖文】：

3-氧化角鯊烯合成的 MVA 途徑和 MEP 途徑[1]鯊烯在角鯊烯環(huán)化酶的催化作用下生成 2,3-氧化角鯊烯，經(jīng)羽扇豆醇合阿喬醇合成酶的催化下分別生成羽扇豆醇和環(huán)阿喬醇等酯類。2,3-氧化β-香樹素合成酶、齊墩果酸合成酶催化下，生成齊墩果酸，然后生成齊

人參皂苷下游生物合成途徑

糖基轉(zhuǎn)移酶催化通路圖

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3 王克夷;糖基轉(zhuǎn)移酶的研究進(jìn)展[J];生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展;1994年01期

4 黃露露;彭麗桃;葉俊麗;楊書珍;;糖基轉(zhuǎn)移酶在果實(shí)品質(zhì)形成過程中的作用研究進(jìn)展[J];食品與機(jī)械;2018年04期

5 鄭華甫;毛多斌;;果糖基轉(zhuǎn)移酶在合成功能性食品添加劑中的應(yīng)用[J];廣西輕工業(yè);2009年03期

6 毛多斌;王雪;;果糖基轉(zhuǎn)移酶及低聚果糖生產(chǎn)研究進(jìn)展[J];廣東化工;2009年04期

7 張斌;夏永振;范仲學(xué);祁慶生;;利用高效陰離子色譜快速檢測篩選環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶產(chǎn)生菌[J];中國生物工程雜志;2009年05期

8 魏遠(yuǎn)安,姚評佳,謝慶武,梁錦添;固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶的理化性質(zhì)及穩(wěn)定性研究[J];廣西大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2002年01期

9 李學(xué)紅;王冰;陸勇;張勇;;4-α-糖基轉(zhuǎn)移酶及其應(yīng)用研究進(jìn)展[J];食品與發(fā)酵工業(yè);2012年05期

10 陳利平;韓亞偉;毛多斌;管麗紅;陳永森;;不同菌株果糖基轉(zhuǎn)移酶的活性鑒定與分析[J];現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技;2009年18期

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6 徐四川;王寧;鄒成亮;王琳;馬麗英;鄧圣榮;經(jīng)山;;ADP核糖基轉(zhuǎn)移酶蛋白活性位點(diǎn)的研究[A];第五屆全國化學(xué)生物學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要集[C];2007年

7 陳大偉;陳日道;解可波;戴均貴;;芒果中一個(gè)具底物雜泛性的新穎C-糖基轉(zhuǎn)移酶[A];2015年中國藥學(xué)大會(huì)暨第十五屆中國藥師周論文集[C];2015年

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9 ;The UDP-glucosyltransferase multigene family in Bombyx mori[A];中國蠶學(xué)會(huì)第六屆青年學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集（1）[C];2009年

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3 于寒松;紅景天糖基轉(zhuǎn)移酶家族基因克隆、鑒定及轉(zhuǎn)基因發(fā)根系統(tǒng)的建立[D];吉林大學(xué);2008年

4 王嵐;依博素生物合成基因ste5、ste22的克隆、表達(dá)和功能研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2008年

5 師偉偉;肺炎鏈球菌中0-連接的糖基轉(zhuǎn)移酶GtfA及其激活子GtfB的結(jié)構(gòu)和功能研究[D];中國科學(xué)技術(shù)大學(xué);2014年

6 郭玉川;分枝硫醇合成相關(guān)糖基轉(zhuǎn)移酶和磷酸酶的研究及肽連接酶Butelasel的異源表達(dá)[D];山東大學(xué);2017年

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8 雷璇;殺念菌素生物合成中糖基轉(zhuǎn)移酶的研究[D];上海交通大學(xué);2013年

9 楊廣宇;利用定向進(jìn)化提高�；乃饷讣疤腔D(zhuǎn)移酶的催化活力[D];吉林大學(xué);2009年

10 王軍;擬南芥細(xì)胞分裂素N-糖基轉(zhuǎn)移酶基因功能分析[D];山東大學(xué);2011年

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1 馮鵬程;西洋參Pq-PPT-6,20-O-UGT和Pq-PPT-6-O-UGT糖基轉(zhuǎn)移酶基因的克隆與功能分析[D];吉林大學(xué);2019年

2 朱國慶;擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶基因UGT73C4參與抗病的作用分析[D];山東大學(xué);2019年

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4 袁帥;虎眼萬年青屬糖基轉(zhuǎn)移酶的挖掘及其在糖苷多樣性中的應(yīng)用[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2018年

5 羅星榮;糖基轉(zhuǎn)移酶工程菌催化井岡羥胺A糖基化的條件優(yōu)化及其酶學(xué)性質(zhì)研究[D];浙江工業(yè)大學(xué);2014年

6 張鳳菊;擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶基因UGT86A1參與植物對非生物脅迫耐性的作用研究[D];山東大學(xué);2018年

7 張鵬;埃博霉素糖基轉(zhuǎn)移酶的初步探究[D];山東大學(xué);2017年

8 楊婷婷;美達(dá)霉素生物合成中糖基轉(zhuǎn)移酶Med-ORF8和調(diào)控蛋白Med-ORF10的機(jī)制研究[D];華中師范大學(xué);2016年

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本文編號：2819869