發(fā)布時間：2020-09-16 12:45

　　 西洋參為五加科多年生草本植物,是世界公認的滋補、藥食兩用植物。西洋參的有效成分為人參皂苷,在強身益智,明目,安精神,止驚悸,延年益壽等方面有著重要的作用。2,3-氧化角鯊烯作為人參皂苷生物合成的中心,分為甲羥戊酸途徑和始于丙酮酸的2-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸(MEP)的上游途徑,以及環(huán)化、羥基化、糖基化等修飾過程的下游途徑。人參屬的藥理學(xué)活性因人參皂苷的種類和含量的不同而異。糖基化是人參皂苷合成的最后一步,也是賦予人參皂苷特異性、多樣性的關(guān)鍵一步。近年來許多學(xué)者對人參皂苷合成的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因做了許多研究,但西洋參相關(guān)葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的研究還不夠充分。本文以實驗室保存的西洋參愈傷組織為材料,用RT-PCR方法成功的獲得三個催化人參皂苷合成的UDP-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因序列,并將三個基因與真核表達載體pAUR123連接,轉(zhuǎn)化到釀酒酵母中,通過超聲波破碎后,用SDS-PAGE蛋白電泳檢測基因表達情況,再用HPLC檢測酶促反應(yīng)產(chǎn)物確定糖基轉(zhuǎn)移酶的功能,最后對發(fā)酵溫度、時間、搖瓶轉(zhuǎn)速三個條件進行優(yōu)化培養(yǎng),具體的研究成果如下:1、糖基轉(zhuǎn)移酶基因的獲得。以有質(zhì)感、生長旺盛的西洋參愈傷組織為材料,用寶生物的全RNA提取試劑盒獲取西洋參的總RNA。用RTaseM-MLV酶催化反轉(zhuǎn)錄出西洋參的cDNA,以人參中PgUGT100、PgUGT101、PgUGT102和PgUGT103為模板設(shè)計簡并引物,以cDNA為模板成功克隆出三條序列,經(jīng)測序后分別確定三條序列均為1428bp,翻譯475個氨基酸,編碼蛋白質(zhì)大小均約為53KDa,對他們的氨基酸序列進行序列比對和同源建模后確定得到目的序列,并命名為序列一、序列二和序列三。2、糖基轉(zhuǎn)移酶的異源表達載體構(gòu)建。將葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因序列一、序列二和序列三與pAUR123連接,構(gòu)建了pAUR123-序列一、pAUR123-序列二和pAUR123-序列三三個重組載體,之后轉(zhuǎn)化到INVSc1釀酒酵母中,經(jīng)菌落PCR和雙酶切鑒定后,成功構(gòu)建Y-pAUR123-序列一、Y-pAUR123-序列二和Y-pAUR123-序列三三個酵母工程菌。3、糖基轉(zhuǎn)移酶表達情況分析。對構(gòu)建的三個工程菌分別進行發(fā)酵培養(yǎng),用SDS-PAGE蛋白電泳檢測工程菌中目的蛋白表達情況,在蛋白電泳圖中三個目的蛋白的特征性條帶都在53KDa,結(jié)果表明三條序列在三個釀酒酵母工程菌中都成功表達。4、將三個重組酵母菌種破碎后的蛋白液作為粗酶液,添加人參皂苷和UDPG后做酶促反應(yīng)。用液相色譜分析酶促反應(yīng)產(chǎn)物,序列一可以催化原人參三醇生成F1,再催化F1生成Rg1,因此將序列一命名為Pq-PPT-6,20-O-UGT,并將核酸序列提交到GenBank獲得檢索號:MK641514,序列二可以催化原人參三醇生成Rh1,因此將序列二命名為Pq-PPT-6-O-UGT,并將核酸序列提交到GenBank獲得檢索號:MK641515,序列三未檢測到催化活性,因此將序列三命名為Pq-PPT-20-O-UGT,并將核酸序列提交到GenBank獲得檢索號:MK641516。5、工程菌發(fā)酵條件優(yōu)化。從發(fā)酵溫度、培養(yǎng)時間、搖瓶轉(zhuǎn)速三個方面對工程菌Y-pAUR123-Pq-PPT-6,20-O-UGT和Y-pAUR123-Pq-PPT-6-O-UGT進行優(yōu)化培養(yǎng),確定了適宜發(fā)酵溫度為30℃,適宜發(fā)酵時間為38h,適宜搖瓶轉(zhuǎn)速為270rpm。
【學(xué)位單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：Q943.2;S567.53
【部分圖文】：

3-氧化角鯊烯合成的 MVA 途徑和 MEP 途徑[1]鯊烯在角鯊烯環(huán)化酶的催化作用下生成 2,3-氧化角鯊烯，經(jīng)羽扇豆醇合阿喬醇合成酶的催化下分別生成羽扇豆醇和環(huán)阿喬醇等酯類。2,3-氧化β-香樹素合成酶、齊墩果酸合成酶催化下，生成齊墩果酸，然后生成齊

人參皂苷下游生物合成途徑

糖基轉(zhuǎn)移酶催化通路圖

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本文編號：2819869