發(fā)布時間：2020-09-14 11:59

　　 HD-Zip是植物特有的轉(zhuǎn)錄因子家族,其參與植物光合作用、形態(tài)發(fā)育等多個生物學(xué)過程。前期生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),該基因家族的HAT22可能參與了植物次生細(xì)胞壁的形成,為了驗(yàn)證HAT22是否參與了植物次生細(xì)胞壁的形成,本文從木本轉(zhuǎn)基因植物中的模式植物毛果楊(Populus trichocarpa)中克隆得到了HAT22的同源基因,并對其組織表達(dá)特異性、轉(zhuǎn)錄因子基本特性以及在楊樹次生細(xì)胞壁形成中的生物學(xué)功能進(jìn)行了研究,主要研究結(jié)果如下。1.克隆了毛果楊HAT22全長為822 bp的CDS序列,將其命名為PtrHAT22。PtrHAT22編碼273個氨基酸,其蛋白具有家族典型HD及Zip結(jié)構(gòu)域,在17-21氨基酸序列處具有LxLxL抑制結(jié)構(gòu)域。毛果楊HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子家族進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn),HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子家族中大多數(shù)成員間具有較高的同源性。2.通過對qRT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析,PtrAT22能夠在毛果楊的根;初生葉片;過渡葉片;次生葉片;過渡韌皮部;次生韌皮部;初生木質(zhì)部;過渡木質(zhì)部;次生木質(zhì)部組織中表達(dá),其可能參與植物多個器官和組織的發(fā)育過程。在所有進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的組織中,PtrHAT22在木質(zhì)部的表達(dá)量最高,表明PtrGAT22的主要功能可能是參與次生細(xì)胞壁合成。為了確定該基因在植物哪些組織中表達(dá),我們進(jìn)行了PtrHAT22啟動子加GUS基因煙草瞬時侵染的染色分析,次生莖部、根部和葉脈處染色較深,表明該基因主要在植物次生細(xì)胞壁形成活躍的組織表達(dá),這與qRT-PCR研究結(jié)果基本一致。3.亞細(xì)胞定位研究表明,PtrHAT22是定位于細(xì)胞核符合大多數(shù)轉(zhuǎn)錄因子定位于細(xì)胞核的特性。轉(zhuǎn)錄激活研究發(fā)現(xiàn),PtrHAT22無自激活性。酵母雜交試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),PtrHAT22能夠與前期預(yù)測的下游調(diào)控靶基因MYB46、MYB58以及C2H2啟動子相結(jié)合。通過對下游其他靶基因啟動子元件分析,選擇出上述基因高頻率元件及與木質(zhì)素合成相關(guān)的元件,對其進(jìn)行酵母雜交試驗(yàn),結(jié)果表明,PtrHAT22能夠與AC-II、Box4、TATA-box和G-Box元件特異性結(jié)合。4.對PtrHAT22過表達(dá)及野生型毛果楊營養(yǎng)生長統(tǒng)計,與野生型毛果楊相比轉(zhuǎn)基因植株OE-2、OE-3、OE-6在株高分別降低了 9.37%、14.9%、28.67%;地徑分別降低了10.73%、9.98%、27.34%;莖節(jié)數(shù)分別降低了 23.61%、12.50%、34.72%;干重分別降低了 36.79%、34.28%、48.06%;鮮重分別降低了 24.51%、21.88%、39.21%;葉片長度分別降低了 40.00%、46.67%、57.78%;葉片寬度分別降低了 50.48%、47.62%、64.76%,轉(zhuǎn)基因株系株高、地徑、莖節(jié)數(shù)、干重鮮重及葉片大小均有顯著降低,PtrHAT22對楊樹的營養(yǎng)生長具有抑制作用。5.PtrHAT22過表達(dá)毛果楊細(xì)胞壁主要組分含量測定發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)基因株系與對照相比,木質(zhì)素含量降低17.15%,纖維素含量降低10.95%,半纖維素含量上升14.68%。同時,纖維的長度下降了 2.46%,寬度下降了13.01%。為研究纖維素、半纖維素、木質(zhì)素及纖維長、寬的變化,會對植物細(xì)胞壁的厚度產(chǎn)生哪些影響我們進(jìn)行了掃描電鏡實(shí)驗(yàn),轉(zhuǎn)基因株系次生細(xì)胞壁厚度下降了 36.29%。過表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系次生細(xì)胞壁形成相關(guān)基因qRT-PCR分析表明,纖維素合成基因CesA4、CesA 7、CesA 8表達(dá)量顯著下降,半纖維素合成基因IRX9表達(dá)量顯著下降而IRX10川的表達(dá)量升高,木質(zhì)素合成基因PAL1的表達(dá)量降低,PAL4、HCT1、CSE2、C4H2、COMT2、CAD1、CCR2、CCoAOMT1 表達(dá)量顯著下降,與PtrHAT22具有結(jié)合能力基因PtrMYTB46、PtrMYB58、PtrYB282表達(dá)量顯著下降,上述基因的表達(dá)變化與次生細(xì)胞壁組分含量的變化基本一致,表明PtrHAT22通過直接或間接調(diào)控上述基因的表達(dá)影響了植物次生細(xì)胞壁的形成。
【學(xué)位單位】：東北林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：Q943.2;S792.11
【部分圖文】：

圖２－２尸／ｒ／＾（ｒ２２基因ＣＤＳ全長ＰＣＲ擴(kuò)增產(chǎn)物及菌液ＰＣＲ檢測逡逑Ａ：邋Ｐ／ｒ／ＭＴ＾Ｊ基因編碼區(qū)全長的ＰＣＲ擴(kuò)增產(chǎn)物；Ｂ：菌液ＰＣＲ檢測逡逑Ｆｉｇ．２－２邋Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ＰｔｒＨＡＴ２２邋ｇｅｎｅ邋ＣＤＳ邋ａｎｄ邋Ｂａｃｔｅｒｉａｌ邋ｌｉｑｕｉｄ邋ＰＣＲ邋ｏｆ邋ＰｔｒＨＡＴ２２逡逑ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ逡逑Ａ：邋Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ＰｔｒＨＡＴ２２邋ｇｅｎｅ邋ＣＤＳ；邋Ｂ：邋Ｂａｃｔｅｒｉａｌ邋ｌｉｑｕｉｄ邋ＰＣＲ邋ｏｆ邋ＰｔｒＨＡＴ２２逡逑ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ逡逑．３．３邋Ｐ／ｒ從４７７２的生物信息學(xué)分析逡逑３．３．１邐／Ｖｒ／＾７７２的基本理化特性逡逑對Ｐ／ｒ凡４７７２的氨基酸序列進(jìn)行了理化特性的分析，分析結(jié)果為：７＾／以７７白由２７３個氨基酸所構(gòu)成，其分子量為３０５３０．５９；等電點(diǎn)（ＰＩ）為８．６８；具負(fù)電荷的氨基酸殘基總數(shù)（Ａｓｐ＋邋Ｇｌｕ）邋：邋３５及帶正電荷的殘基總數(shù)（Ａｒｇｓ）邋：邋４０所組成；原子組成為碳元素Ｃ邋１３０８、氫元素Ｈ邋２１２０、氮元素Ｎ邋３８８元素０邋４１９、硫元素Ｓ１７，其分子式為Ｃ丨３Ｇ８Ｈ２Ｉ２ＧＮ３r潰埃簇梗迂罰幼蓯擔(dān)�。辶x

本文編號：2818149