銀杏(Ginkgo biloba L.)屬于單科單屬裸子植物,是原產(chǎn)于我國的一種現(xiàn)存最古老的孑遺物種。銀杏較長的童期嚴(yán)重阻礙了銀杏育種的進(jìn)程,限制了銀杏的經(jīng)濟(jì)效益和社會價值。已有研究表明,MADS-box基因家族成員能夠縮短植物童期,促進(jìn)開花。本研究結(jié)合銀杏轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù),篩選到15個銀杏MADS-box家族基因,并對其中的Gb16301(命名為GBM5)和Gb01884(命名為GBM6)進(jìn)行序列分析和表達(dá)分析。主要研究結(jié)果如下:1、銀杏MADS-box家族基因成員的鑒定對銀杏花芽分化時期的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選,得到15個銀杏MADS-box家族基因,15個基因編碼的蛋白長度在150-450 aa之間;蛋白分子量在19373.4-50 951.76 Da之間;在染色體中的分布不均勻。聚類分析顯示,銀杏15個MADS-box家族基因中屬于I型Mγ亞族的有2個,屬于MIKC型基因有13個,進(jìn)一步分類到TM3、TM8、AG、GGM13、SVP亞族。2、銀杏GBM5和GBM6基因的克隆采用RT-PCR技術(shù),以銀杏莖端的cDNA為模板,根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的序列信息設(shè)計特異性引物,克隆得到了GBM5(Gb16301)和GBM6(Gb01884)的全長CDS序列。GBM5包含一段732 bp的開放閱讀框,預(yù)測其編碼的蛋白質(zhì)的分子式為C1188H1923N357O366S12。GBM6基因包含一段756 bp的開放閱讀框,預(yù)測其分子式為C2251H3748N756O917S163。3、銀杏GBM5和GBM6的表達(dá)分析及表達(dá)載體的構(gòu)建結(jié)合聚類分析結(jié)果和表達(dá)分析數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn),銀杏GBM5基因與蘇鐵等其他物種的AG基因同源性較高,表達(dá)模式與其他植物AG基因的表達(dá)模式相似,即在莖端和葉片中的表達(dá)量隨著花芽分化過程呈顯著下降的趨勢。銀杏GBM6基因在銀杏葉片中的表達(dá)量較高,在銀杏莖端和葉片中的表達(dá)量隨著花芽分化過程呈顯著下降的趨勢,且在葉片中下降的幅度較大。本實驗成功構(gòu)建了pEGAD-GBM5和pEGAD-GBM6過表達(dá)載體,以便進(jìn)一步研究GBM5和GBM6基因的功能。
【學(xué)位單位】：中南林業(yè)科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：Q943.2
【部分圖文】：

選取擬南芥、水稻、買麻藤、挪威云杉、油松、日本柳杉的ＭＡＤＳ－ｂｏｘ蛋逡逑白共計８３條蛋白序列，與轉(zhuǎn)錄組測序篩選到的１５個銀杏ＭＡＤＳ－ｂｏｘ蛋白利用逡逑ＭＥＧＡ７．０構(gòu)建Ｉ型和ＭＩＫＣ型ＭＡＤＳ－ｂｏｘ蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果如圖２＿２和２．３逡逑所示，黑色實心標(biāo)注的為銀杏的２條Ｉ型和１３條ＭＩＫＣ型ＭＡＤＳ－ｂｏｘ蛋白。逡逑系統(tǒng)發(fā)育學(xué)中一般將Ｉ型ＭＡＤＳ－ｂｏｘ蛋白分為Ｍｃｕ邋Ｍｐ和Ｍｙ。隨機(jī)選取擬逡逑南芥ｏｕ邋（３、ｙ三種類型的１１條蛋白序列與Ｇｂ３３１６８和Ｇｂ３８８８３構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)逡逑育進(jìn)化樹，結(jié)果（圖２．２）顯示：Ｇｂ３３１６８和Ｇｂ３８８８３與擬南芥Ｙ型蛋白聚為一逡逑支

樣品總ＲＮＡ圖譜中２８Ｓ邋ｒＲＮＡ條帶、１８Ｓ邋ｒＲＮＡ條帶及５Ｓ邋ｒＲＮＡ條帶均較為明逡逑顯，說明提取的總ＲＮＡ較完整，條帶清晰，所提取的ＲＮＡＯＤ２６0ｎｍ／ＯＤ２８Ｇｎｎ＾逡逑介于１．９－２．０之間，純度較高，滿足后續(xù)實驗的需要（圖３．１）。逡逑１逡逑■逡逑圖３．１銀杏莖端樣品總ＲＮＡ逡逑Ｆｉｇ邋３．１邋Ｓｔｅｍ邋ａｐｅｘ邋ＲＮＡ邋ｏｆ邋０／＞７故６＞邐Ｌ逡逑２７逡逑

３．３．２．１邋Ｇ５Ｍ５基因的克隆逡逑以銀杏莖端的ｃＤＮＡ為模板，以特異性引物及為引逡逑物，通過ＰＣＲ擴(kuò)增得到了長度為７３２邋ｂｐ的ＤＮＡ片段（圖３．２），篩選單個陽性克逡逑隆菌株（圖３．３）測序，在ＮＣＢＩ上對測序結(jié)果進(jìn)行序列比對，與銀杏逡逑家族中的ＡＧＡＭＯＵＳ－ｌｉｋｅ基因Ｇ５Ｍ５（登錄號：ＡＹ１１４３０４．１）的比對率較高，因此逡逑對克隆到的序列命名為ＧＳＭ５。逡逑圖３．２ＧＢＭ５基因克隆逡逑Ｆｉｇ邋３．２邋ＰＣＲ邋ｐｒｏｄｕｃｔ邋ｏｆ邋ＧＢＭ５逡逑Ｍ：ＭＤ１１６邋ＤＮＡＭａｒｋｅｒ邋；邋１：目的基因逡逑Ｍ邐１２邐３邐４逡逑ｍｍ逡逑ｍｓｍ逡逑圖３．３邋ＧＢＭ５菌液ＰＣＲ檢測逡逑Ｆｉｇ邋３．３邋Ｂａｃｔｅｒｉａ邋ｌｉｑｕｉｄ邋ＰＣＲ邋ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＧＢＭ５逡逑Ｍ：ＭＤ１１６邋ＤＮＡ邋Ｍａｒｋｅｒ邋；邋１－４：目的基因逡逑２８逡逑

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2817734