在生物進(jìn)化的過(guò)程中,Ca2+成為真核生物中重要的第二信使之一。在響應(yīng)生物或非生物脅迫時(shí),細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度會(huì)發(fā)生特異的時(shí)空變化,這種特異的變化被稱之為Ca2+信號(hào)。為了響應(yīng)這些特異的鈣信號(hào),植物體內(nèi)逐步產(chǎn)生了大量的Ca2+感受器和效應(yīng)器。擬南芥 calcineurin B-like(CBL)和 CBL interacting protein kinase(CIPK)是其中一類(lèi)典型的Ca2+信號(hào)感知和解碼蛋白復(fù)合物,調(diào)控了一系列下游蛋白的應(yīng)激響應(yīng)。近些年來(lái),活性氧ROS也被發(fā)現(xiàn)是另一類(lèi)重要的第二信使,尤其在植物免疫反應(yīng)以及長(zhǎng)距離信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中有關(guān)鍵作用。最近的研究表明,Ca2+信號(hào)通路與ROS信號(hào)通路之間存在著某種關(guān)聯(lián)。本研究發(fā)現(xiàn),擬南芥NADPH氧化酶RBOH是Ca2+信號(hào)和ROS信號(hào)的一個(gè)重要結(jié)合點(diǎn)。本研究通過(guò)生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和遺傳學(xué)等手段對(duì)CBL/CIPK調(diào)控RBOHF蛋白活性的分子機(jī)理進(jìn)行了深入研究。本研究發(fā)現(xiàn),在人腎胚(HEK)293T細(xì)胞異源表達(dá)系統(tǒng)中,CIPK26和CIPK11均能夠與CBL1/9 一起激活RBOHF的活性。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),CIPK11和CIPK26對(duì)RBOHF的激活不存在協(xié)同效應(yīng),推測(cè)CIPK11和CIPK26可能在不同信號(hào)通路中起作用或者二者存在功能冗余。生化結(jié)果顯示,CIPK11和CIPK26均在體外磷酸化RBOHF-N,而且施加Ca2+能夠增強(qiáng)RBOHF-N的磷酸化強(qiáng)度。在HEK293T細(xì)胞中進(jìn)行深入分析發(fā)現(xiàn),RBOHF的激活依賴于CIPK26的激酶活性以及CBL1/CIPK26復(fù)合物的細(xì)胞膜定位;而RBOHF活性的進(jìn)一步增強(qiáng)依賴于Ca2+對(duì)RBOHF的結(jié)合。因此,磷酸化和Ca2+的結(jié)合對(duì)RBOHF的激活是至關(guān)重要的,而且二者似乎能夠互相增強(qiáng)彼此的功能。本研究還發(fā)現(xiàn)另一個(gè)重要的蛋白激酶open stomata 1(OST1/SnRK2.6)也能夠在HEK293T細(xì)胞中調(diào)控RBOHF的活性。在HEK293T細(xì)胞中,對(duì)OST1的N端增加一個(gè)細(xì)胞膜定位的信號(hào)(PM)后發(fā)現(xiàn),PM-OST1強(qiáng)烈地激活RBOHF。該發(fā)現(xiàn)表明OST1在細(xì)胞膜上的活性受到如蛋白間互作或者蛋白修飾等未知機(jī)制的調(diào)控。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),ABA信號(hào)通路中的OST1和Ca2+依賴的的CBL1/CIPK26在激活RBOHF上存在協(xié)同機(jī)制。質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn),CIPK26和OST1作用于RBOHF-N的位點(diǎn)存在異同。在HEK293T細(xì)胞中對(duì)這些位點(diǎn)的功能分析使得對(duì)RBOHF的調(diào)控機(jī)制能夠進(jìn)行深入的解析。最后,本研究發(fā)現(xiàn)蛋白磷酸酶PP2C家族成員ABI1強(qiáng)烈抑制CBL1/CIPK26和PM-OST1對(duì)RBOHF的激活,從而負(fù)調(diào)控RBOHF的活性。綜上所述,我們的研究表明,在擬南芥NADPH氧化酶RBOHF被激活后,其介導(dǎo)的ROS生成能夠在很短時(shí)間內(nèi)迅速增強(qiáng),而RBOHF的激活依賴于蛋白激酶的磷酸化以及Ca2+的結(jié)合。同時(shí),我們也發(fā)現(xiàn),RBOHF的活性不僅受到Ca2+依賴的多個(gè)蛋白激酶的調(diào)控,而且也受到Ca2+不依賴的蛋白激酶調(diào)控,從而揭示了 RBOHF調(diào)控機(jī)制的復(fù)雜性。根據(jù)本研究的結(jié)果,我們對(duì)RBOHF的復(fù)雜調(diào)控機(jī)制提出如下的模型:植物體在響應(yīng)外界脅迫或者發(fā)育過(guò)程中的刺激信號(hào)時(shí),快速形成的特異Ca2+信號(hào)能夠通過(guò)Ca2+結(jié)合到RBOHF和Ca2+依賴的磷酸化在數(shù)秒或者數(shù)分鐘內(nèi)迅速的激活RBOHF;而經(jīng)過(guò)較長(zhǎng)時(shí)間合成的ABA能夠激活OST1,從而增強(qiáng)和維持RBOHF介導(dǎo)的ROS生成。當(dāng)脅迫或者刺激信號(hào)減弱時(shí),ABA濃度的降低使ABI1的活性得到增強(qiáng),ABI1去磷酸化RBOHF,從而抑制其功能。通過(guò)這種方式,RBOHF的磷酸化和去磷酸化得以平衡,使得植物體內(nèi)ROS的生成得到精細(xì)的調(diào)控。RBOHF的這些復(fù)雜調(diào)控機(jī)制的生物學(xué)意義也會(huì)隨著研究方法的不斷改進(jìn)而被逐步揭示,而這些機(jī)制對(duì)于研究其它NADPH氧化酶的調(diào)控也有重要的參考價(jià)值。
【學(xué)位單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類(lèi)】：Q943.2
【部分圖文】：

雙熒光蛋白的ＧＥＣＩｓ主要基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)（ＦＲＥＴ），大多數(shù)包含逡逑ＣａＭ－Ｍ１３邋Ｃａ２＋感受域和以三明治結(jié)構(gòu)包夾它們的青色和黃色兩種熒光蛋白的變異體逡逑（Ｍｉｙａｗａｋｉ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋１９９７）（圖１－１）。當(dāng)Ｃａ２＋結(jié)合到ＣａＭ上之后，該融合蛋白的構(gòu)象發(fā)生逡逑改變，激發(fā)光照射后會(huì)發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，這種熒光強(qiáng)弱的變化就反映了特異的逡逑Ｃａ２＋信號(hào)。隨后，Ａｌｌｅｎ等將這種檢測(cè)Ｃａ２＋的方法運(yùn)用到了植物中（Ａｌｌｅｎ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋１９９９）。逡逑ＶＦＰ逡逑牛逡逑－Ｃａ２＋邐＋Ｃａ邋２＋逡逑ＣＦＰ逡逑＋邋Ｃａ邋２＋逡逑圖１－１雙勞光Ｃａ２’指示蛋白Ｃａｍｅｌｅｏｎ結(jié)構(gòu)示意圖（Ｍｉｙａｗａｋｉ邋ｅｔａｌ．，１９９７有修改）逡逑示意圖展示了兩個(gè)熒光蛋白如何通過(guò)ＦＲＥＴ來(lái)檢測(cè)Ｃａ２＋。在沒(méi)有Ｃａ２＋時(shí)，ＣａＭ和Ｍ１３無(wú)法結(jié)合，逡逑ＦＲＥＴ不能產(chǎn)生；當(dāng)Ｃａ２＋結(jié)合到ＣａＭ后，Ｃａ２＋－ＣａＭ－Ｍ１３復(fù)合物的構(gòu)象改變，促進(jìn)ＦＲＥＴ的發(fā)生。逡逑３逡逑

結(jié)構(gòu)分析顯示，二者具有經(jīng)典的絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶折疊結(jié)構(gòu)，而且主要分為兩逡逑瓣，中間由激活環(huán)連接，序列分析也發(fā)現(xiàn)這些結(jié)構(gòu)在ＣＩＰＫ家族中都很保守逡逑（Ｃｈａｖｅｓ－Ｓａｎｊｕａｎ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋２０１４）（圖１－４）。單個(gè)ＣＢＬ能夠與多個(gè)ＣＩＰＫ互作來(lái)行使功能，而逡逑單個(gè)邋ＣＩＰＫ邋也可以和多個(gè)邋ＣＢＬ邋互作（Ａｌｂｒｅｃｈｔ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋２００１；邋Ｄ’Ａｎｇｅｌｏ邋ｅｔ邋ａｌ．，２００６）。這樣逡逑的ＣＢＬ／ＣＩＰＫ互作網(wǎng)絡(luò)使得在Ｃａ２＋信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中可以保證有效的信號(hào)流通（Ｋｕｄｌａ逡逑ｅｔ邋ａｌ．，２０１０）。逡逑ｎｎ逡逑邐邋？0逡逑邐邐＇Ｖ逡逑ｍ「Ｉ邋贏邋知逡逑Ｅｕｄｉｃｏｔｙｌｅｄｏｎｓ逡逑Ｍｏｎｏｃｏｔｙｌｅｄｏｎｓ邋Ｉ逡逑／邐＾邐一’ｔ二邋Ｇｙｍｎｏｓｐｅｒｍ邐ｉ邐／逡逑ｖｊｆ邋ＬＬＪ邋ｐｔｅｒｉ７＾ａ邋．邋ｙ逡逑Ｃｈａｒｏｐｈｙｔａ邋ｉｌｌ／逡逑Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ邋＼邐１邐Ｊ邐／逡逑ｊＶＤＣＣ逡逑ｊＰ２Ｘ邋ＲｔＣｙｓ－ｌｏｏｐ＊邋ＣＣａＭＫ逡逑／？ＳＴＩＭ邋ＣＢＬ邋１邐３邐５邐４邐７邐１１邐１０逡逑／邐ＣＩＰＫ邋１邐１邐７邐５邐２６邐３４邐２６逡逑１邐ＣＤＰＫ３邐１２邐２５邐１０邐１３邐３１邐３４逡逑Ｄｅｃｒｅａｓｉｎｇ邋ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ邐．邋Ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ邋ａｂｕｎｄａｎｃｅ逡逑圖１－３植物Ｃａ２＋信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)元件的進(jìn)化示意圖（Ｅｄｅｌｅｔａｌ．，２０１７）逡逑植物在從水生到陸生的進(jìn)化過(guò)程中，Ｃａ２＋信號(hào)元件在各自的進(jìn)化位置出現(xiàn)顯著減少（紅色箭頭）逡逑和增加（綠色箭頭）。藍(lán)色代表海洋

１．２．３邋ＣＢＬ／ＣＩＰＫ調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的功能和機(jī)理逡逑近些年來(lái)越來(lái)越多的ＣＢＬ／ＣＩＰＫ復(fù)合物被報(bào)道參與了離子轉(zhuǎn)運(yùn)、非生物脅迫響應(yīng)、逡逑植物發(fā)育和免疫反應(yīng)等過(guò)程（圖１－５）。ＣＢＬ／ＣＩＰＫ復(fù)合物對(duì)底物的調(diào)控主要是在細(xì)胞逡逑膜上，而定位于液泡膜的ＣＢＬ／ＣＩＰＫ復(fù)合物的功能還不是很清楚，但是定位于液泡膜逡逑的ＣＢＬｓ在調(diào)控液泡ｐＨ、Ｋ＋動(dòng)態(tài)平衡和ＡＢＡ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面均有報(bào)道（Ｂａｔｉｓｔｉｃ邋ｅｔ邋ａｌ．，逡逑２０１２；邋Ｌｉｕ邋ｅｔ邋ａｌ．，２０１３；邋Ｔａｎｇ邋ｅｔ邋ａｌ．，２０１２）。ＣＢＬ２蛋白的Ｎ端經(jīng)過(guò)硫�；揎椇笫蛊涠ㄎ诲义嫌谝号菽ど�，Ｍ／２突變體不能對(duì)ＡＢＡ做出正常響應(yīng)，主要表現(xiàn)為在添加有ＡＢＡ的培逡逑養(yǎng)基上，ｃＷ２突變體不能正常萌發(fā)（Ｂａｔｉｓｔｉｃ邋ｅｔ邋ａｌ．，２０１２）。然而，擬南芥的ＣＢＬ２如何通逡逑過(guò)液泡內(nèi)的Ｃａ２＋信號(hào)調(diào)控ＡＢＡ響應(yīng)的依然不清楚。雖然ＣＢＬ２和ＣＢＬ３的蛋白序列逡逑有９２％的相似性，但是只有ｃＷ２單突變體表現(xiàn)出ＡＢＡ超敏感的表型，表明ＣＢＬ２和逡逑ＣＢＬ３的功能在調(diào)控ＡＢＡ響應(yīng)過(guò)程中并不冗余。另有文獻(xiàn)報(bào)道，在低Ｋ＋脅迫下ＣＢＬ３逡逑與ＣＩＰＫ９參與到調(diào)控Ｋ＋動(dòng)態(tài)平衡中

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本文編號(hào)：2810139