在植物面對(duì)不斷變化的環(huán)境中,基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)幾乎參與了所有的過程。轉(zhuǎn)錄因子是調(diào)節(jié)基因表達(dá)水平的關(guān)鍵,而NAC轉(zhuǎn)錄因子是植物特有的轉(zhuǎn)錄因子,能夠參與調(diào)控植物多種生物過程。但是有關(guān)NAC轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控植物激素信號(hào)傳導(dǎo)途徑來應(yīng)答病毒入侵的機(jī)制還很不清楚。我們研究了本生煙NbNAC1轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控植物激素信號(hào)傳導(dǎo)途徑來應(yīng)答病毒入侵的機(jī)制。首先我們通過RT-PCR的方法成功從本生煙中克隆得到NbNAC1的全長序列。系統(tǒng)發(fā)生進(jìn)化樹構(gòu)建的結(jié)果表明,NbNAC1與抗逆反應(yīng)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子番茄S1NAC1和辣椒CaNAC1的親緣關(guān)系最近。共定位實(shí)驗(yàn)表明NbNAC1定位于細(xì)胞核,酵母單雜交實(shí)驗(yàn)證明了其C端具有轉(zhuǎn)錄激活活性。熒光定量PCR結(jié)果表明,煙草花葉病毒(TMV)侵染本生煙后能夠誘導(dǎo)NbNAC1基因的表達(dá)。然后我們利用病毒誘導(dǎo)的基因沉默技術(shù)將NbNAC1的表達(dá)成功抑制后接種TMV。和對(duì)照相比,沉默NbNAC1的植株中病毒大量積累,并且沉默植株中活性氧爆發(fā)。說明抑制NbNAC1的表達(dá),植物的系統(tǒng)性抗性減弱。進(jìn)一步研究表明,沉默NbNAC1的植株,水楊酸(SA)含量顯著下降,SA合成與信號(hào)途徑關(guān)鍵酶基因MbICS1、NbNPR1、以及SA介導(dǎo)的防御基因NbPR1、NbPR2、NbPR5的表達(dá)顯著下調(diào)。之后同時(shí)缺失SA和NAC信號(hào),研究植物系統(tǒng)性抗性是否發(fā)生變化。在接種TMV后,同時(shí)缺失SA和NAC信號(hào)的植株中病毒大量積累,活性氧爆發(fā),植物變得對(duì)TMV超級(jí)敏感,丙二醛和電導(dǎo)率的結(jié)果也表明細(xì)胞膜損傷更為嚴(yán)重,說明植物的系統(tǒng)性抗性進(jìn)一步顯著減弱。另外利用水楊酸處理缺失NAC信號(hào)的植株,結(jié)果顯示可以部分地恢復(fù)由于缺失NAC信號(hào)所丟失的抗性。因此我們認(rèn)為,NbNAC1轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控植物系統(tǒng)性抗性防御病毒入侵過程中起重要作用,可能調(diào)控SA信號(hào)途徑應(yīng)答病毒入侵。該研究為利用基因工程原理改良農(nóng)作物的抗逆性,培育優(yōu)良品種,增強(qiáng)植物對(duì)病原菌的抵抗力提供重要的理論依據(jù)。為了更深入研究轉(zhuǎn)錄因子NbNAC1在激素信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中作為關(guān)鍵調(diào)控因子的調(diào)控作用,探索NbNAC1與水楊酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑蛋白質(zhì)互作模式,有必要通過DNA重組技術(shù)獲得NbNAC1重組蛋白并制備血清抗體。原核表達(dá)系統(tǒng)能夠便捷高效地獲得目的蛋白,因此構(gòu)建高效的表達(dá)體系是獲得NbNAC1蛋白的關(guān)鍵。我們選擇了兩種標(biāo)簽的表達(dá)載體,成功構(gòu)建了 pET28a-NbNAC1和 pGEX-4T-1-NbNAC1 載體,利用 E coil Rosetta(DE3)菌株進(jìn)行表達(dá)。通過對(duì)誘導(dǎo)條件探索,我們發(fā)現(xiàn)兩種載體都是在37℃、1mMIPTG誘導(dǎo)條件下表達(dá)量最大。經(jīng)SDS-PAGE電泳檢驗(yàn),pGEX-4T-1-NbNAC1載體表達(dá)的蛋白是可溶性蛋白,主要集中在上清中可以直接用GST介質(zhì)純化。而pET28a-NbNAC1載體表達(dá)后形成包涵體蛋白,主要集中于沉淀中,我們利用包涵體復(fù)性技術(shù),成功制備NbNAC1蛋白。將蛋白乳化處理后,直接對(duì)大白兔進(jìn)行注射,獲得血清抗體,經(jīng)Westernb1ot檢測(cè),獲得的血清抗體具有較高效價(jià),可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。本研究探索了兩套解決原核表達(dá)包涵體蛋白問題的方案,成功純化出NbNAC1蛋白并制備出血清抗體,為后續(xù)研究NbNAC1與SA互作奠定基礎(chǔ),也為原核表達(dá)體系中包涵體問題的解決提供新的策略。
【學(xué)位單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：Q943.2
【部分圖文】：

經(jīng)注釋編碼基因的５．９％，轉(zhuǎn)錄因子做為復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中的成員，在調(diào)節(jié)植物應(yīng)對(duì)來逡逑圍環(huán)境脅迫反應(yīng)的過程中，發(fā)揮著重要的作用ｔ２＂６１。逡逑ＮＡＣ轉(zhuǎn)錄因子其命名來源于科學(xué)家從矮牽牛和擬南芥逡逑中克隆出來的邋ＮＡＣ邋基因邋ＮＡＭ邋（Ｎｏ邋Ａｐｉｃａｌ邋Ｍｅｒｉｓｔｅｍ）邋［７］，ＡＴＡＦ１／２邋（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｉａｎａ邋ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）和邋ＣＵＣ２邋（ｃｕｐ－ｓｈａｐｅｄ邋ｃｏｔｙｌｅｄｏｎ）邋［８］。他們所編碼的蛋白質(zhì)，Ｎ邋端結(jié)逡逑氨基酸序列都高度保守且具有較高的同源性。逡逑ＮＡＣ轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)逡逑典型的ＮＡＣ轉(zhuǎn)錄因子蛋白具模塊化組織，通常由高度保守的Ｎ端結(jié)構(gòu)域和一個(gè)可高的Ｃ端轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)域組成。Ｎ端結(jié)構(gòu)域一般包含１５０個(gè)氨基酸，能夠再次細(xì)分為５個(gè)逡逑構(gòu)域（Ａ－Ｅ）［９］。在５個(gè)亞結(jié)構(gòu)域中，核定位作用以及參與ＤＮＡ結(jié)合的功能主要由Ａ、逡逑保守性較氋的亞結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)；Ｂ、Ｅ這兩個(gè)亞結(jié)構(gòu)域與生長發(fā)育期的調(diào)控和植物組織逡逑性等有關(guān)，是ＮＡＣ轉(zhuǎn)錄因子功能多樣性決定性區(qū)域，所以保守性較低，具有發(fā)散性。逡逑蛋白Ｃ端具有高度特異性，是轉(zhuǎn)錄激活功能區(qū)，能起到轉(zhuǎn)錄激活或轉(zhuǎn)錄抑制作用逡逑Ａ邋．邋．．邋．．邐．．．邐．邐Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ邋ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，邋ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ，逡逑ＤＮＡ／ｐｒｏｔｅｔｎ邋ｂｍｄ．ｎｇ／ｄｉｍｅｎｚａｔｉｏｎ

共同調(diào)控角果成熟，并在角果細(xì)胞的程序化死亡過程扮演主要角色［１８］。逡逑１．３．２參與非生物脅迫逡逑關(guān)于ＮＡＣＴＦｓ在非生物脅迫中的功能，前人己做了深入研究（圖２）。在擬南芥中，逡逑通過對(duì)和ａｔｏ／７－２突變體［１９１以及ＡＴＡＦ１轉(zhuǎn)基因過表達(dá)植株的研究［２Ｇ］，我們可知逡逑ＡＴＡＦ１在干旱脅迫中既可能是正調(diào)控也可能是負(fù)調(diào)控，這可能是由于ＮＡＣ基因在擬南芥逡逑中功能冗余造成的［１９，２１］。植物激素ＡＢＡ、干旱脅迫、高溫脅迫都能誘導(dǎo)ＡＮＡＣ０５５和逡逑ＡＮＡＣ１９，這兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子可以和脫水誘導(dǎo)早期應(yīng)答基因ＥＲＤ１啟動(dòng)子特異結(jié)合，進(jìn)一步逡逑過量表達(dá)和能夠誘導(dǎo)下游抗旱相關(guān)靶基因的表達(dá)，從而提高擬南芥的逡逑抗旱性［２２］。擬南芥中ＮＡＣ家族的另一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子ＮＡＣ０１６，可以與下游靶基因兄？的逡逑啟動(dòng)子結(jié)合，抑制」及五５７表達(dá)番茄中過量表達(dá)基因，能夠誘導(dǎo)低溫脅迫相關(guān)基逡逑因的表達(dá)

１．３．３參與生物脅迫逡逑大量研宄報(bào)道ＮＡＣＴＦｓ在針對(duì)不同病原體調(diào)控植物防御反應(yīng)方面也具有重要作用。如逡逑圖３所示ＮＡＣ轉(zhuǎn)錄因子作為應(yīng)對(duì)生物脅迫轉(zhuǎn)錄調(diào)控的關(guān)鍵組分，調(diào)控植物防御反應(yīng)。逡逑ＮＡＣ蛋白可通過植物激素信號(hào)途徑激活抗病相關(guān)基因（Ｐｉ？），通過在感染部位誘導(dǎo)超逡逑敏反應(yīng)（ＨＲ）使細(xì)胞程序性死亡，來調(diào)節(jié)植物防御反應(yīng)［２８，２９】。研宄表明，ＮＡＣ基因在參與逡逑植物不同的激素信號(hào)傳導(dǎo)途徑中發(fā)揮不同的調(diào)節(jié)作用。擬南芥中可以被植物激素逡逑ＪＡ、ＳＡ誘導(dǎo)表達(dá)，而ＪＡ、ＳＡ是植物抗病防御途徑的關(guān)鍵激素。過量表達(dá)ＪＺ４Ｆ２會(huì)使擬逡逑南芥中抗病相關(guān)基因表達(dá)下調(diào)，對(duì)病原真菌的抵抗力明顯下降，這說逡逑明在抗病反應(yīng)中起負(fù)調(diào)節(jié)作用［３（）Ｕ水稻稻瘟病菌能夠誘導(dǎo)ＣＷ＼＾Ｃ＜５的表達(dá)，逡逑ＯｓＡ＾ａ？與擬南芥親緣關(guān)系密切。此外還發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)基因的水稻中稻瘟病逡逑菌入侵速度大大減緩，水稻抗稻瘟病的能力顯著上升［２５］。ＣＷＶ＾Ｃ７９基因可以被茉莉酸甲酯逡逑（ＭｅＪＡ）、脫落酸（ＡＢＡ）、乙烯（ＥＴ）等誘導(dǎo)表達(dá)

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