【摘要】：細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)活性的動態(tài)平衡被多重反饋環(huán)路調(diào)控以確保小鼠胚胎干細(xì)胞(mouse embryonic stem cells,mESCs)正常的自我更新。以前的研究證明,在mESCs中存在多種阻止ERK磷酸化(pERK)過度激活的負(fù)反饋環(huán)路。但是,在mESCs中一直都不清楚是否存在正反饋環(huán)路來維持pERK的最低水平。有研究表明pERK進(jìn)入細(xì)胞核后可以激活一系列的轉(zhuǎn)錄因子,包括Etv4、Etv5、Dusp6、Spry和Sef等。其中Dusp6、Spry和Sef作為負(fù)反饋調(diào)控來調(diào)節(jié)pERK的水平,而Etv4和Etv5是通過負(fù)反饋還是正反饋調(diào)控來維持pERK的水平并不清楚。本研究用CRISPR/Cas9對Etv5基因進(jìn)行了敲除(KO),再根據(jù)Etv5敲低(KD)的RNA-seq數(shù)據(jù),用qPCR、Western blot、生物信息學(xué)分析、啟動子克隆、雙熒光素酶檢測和甲基化測序等實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測,主要獲得以下結(jié)果:1.用CRISPR/Cas9在mESCs中敲除Etv5本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了一對特異靶向Etv5基因第7號外顯子的sgRNA,將其通過分子克隆連接到PX459M載體中,通過基因敲除獲得了Etv5 KO B10、B13和B23三株克隆。2.確立了Etv5和pERK之間的正調(diào)控關(guān)系在Etv5 KO的mESCs中pERK蛋白的表達(dá)水平降低。Etv5 KO mESCs的生長速度減慢、Otx2基因表達(dá)顯著上調(diào)、細(xì)胞核可以被熒光染料Hoechst 33258深染。3.在mESCs中發(fā)現(xiàn)了Etv5-Tet2-Fgfr2軸介導(dǎo)的正反饋環(huán)路來調(diào)控pERK為了探索在Etv5 KO mESCs中導(dǎo)致pERK下調(diào)的分子機(jī)制,本研究分析了之前在mESCs中Etv5 KD的RNA-seq數(shù)據(jù)來確定FGF-ERK信號通路中哪個基因的表達(dá)既顯著下調(diào)又能夠使pERK去磷酸化,最終發(fā)現(xiàn)Fgfr2在Etv5 KD mESCs中不僅顯著下調(diào)其表達(dá)豐度在mESCs中也比較高。在Etv5 KO mESCs中Fgfr2的mRNA和蛋白表達(dá)水平也都下降。為了進(jìn)一步研究Etv5是怎樣調(diào)控Fgfr2的表達(dá),我們將生物信息學(xué)預(yù)測的Fgfr2啟動子克隆到了PGL3載體中,雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)的檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組相比過表達(dá)Etv5僅能產(chǎn)生大約兩倍的熒光強(qiáng)度。為了探究Etv5是否通過其它因子的介導(dǎo)來調(diào)控Fgfr2的表達(dá),我們使用Cistrome網(wǎng)站中的ChIP數(shù)據(jù)庫,分析了結(jié)合在Fgfr2啟動子區(qū)的轉(zhuǎn)錄因子,結(jié)果發(fā)現(xiàn)有43個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合在Fgfr2啟動子區(qū),而在這43個因子中Tet2在Etv5 KD后下調(diào)最顯著。Tet2的mRNA和蛋白在Etv5 KO mESCs中的表達(dá)也都顯著下降。我們又檢測了Fgfr2啟動子區(qū)的甲基化程度,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在所檢測的Fgfr2啟動子區(qū)Etv5 KO后的甲基化程度為16.7%,而野生型J1細(xì)胞甲基化程度為2.5%。總之,我們在mESCs中發(fā)現(xiàn)了調(diào)控pERK的一個新模式,即Etv5促進(jìn)Tet2的表達(dá),而Tet2去甲基化Fgfr2啟動子區(qū)從而促進(jìn)Fgfr2的表達(dá),Fgfr2反過來再繼續(xù)激活ERK信號通路,這為理解早期胚胎發(fā)育過程中細(xì)胞命運(yùn)決定提供了新的參考。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：Q75

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本文編號：2805622