【摘要】：核桃內(nèi)生真菌具有豐富的生物多樣性,為了更好地利用這種微生物資源,本研究在核桃內(nèi)生真菌活性菌株篩選、發(fā)酵條件優(yōu)化、代謝產(chǎn)物分離純化,以及抑菌機理等方面進行研究,主要結(jié)果如下:(1)采用生長速率法,以6種常見植物病原菌為指示菌,對16株核桃內(nèi)生真菌進行活性篩選。結(jié)果表明,1株來源于良種核桃樹根部的內(nèi)生真菌G3,其發(fā)酵產(chǎn)物對6種病原菌均表現(xiàn)出一定的抑菌活性。其中對蘋果腐爛病原菌抑制率達到100%,完全抑制了病原菌菌絲生長;對水稻紋枯、核桃炭疽病原菌抑制率均大于75%。通過形態(tài)學特征觀察結(jié)合分子生物學鑒定,G3確定為彎角鐮刀菌Fusarium camptoceras。(2)以接種量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵天數(shù)為影響因子,以G3發(fā)酵產(chǎn)物對蘋果腐爛病原菌的抑制率為評價指標,通過單因素試驗、正交試驗對核桃內(nèi)生真菌G3的發(fā)酵工藝條件進行優(yōu)化。結(jié)果表明,G3發(fā)酵的最優(yōu)工藝為:接種量10%,發(fā)酵溫度28℃,發(fā)酵時間30 d;此工藝條件下,G3發(fā)酵產(chǎn)物對蘋果腐爛病原菌抑制率為85.17%。影響因子對抑制率的影響依次為:發(fā)酵溫度發(fā)酵天數(shù)接種量。(3)采用液液分配方法,對核桃內(nèi)生真菌G3固體發(fā)酵產(chǎn)物的乙醇提取物依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分別進行萃取。結(jié)果表明,正丁醇相和乙酸乙酯相對蘋果腐爛病原菌抑制的IC_(50)值分別為3.3 mg/mL和4.3 mg/mL;結(jié)合各萃取相質(zhì)量及其對蘋果腐爛病原菌抑制效果綜合考慮,選擇正丁醇相和乙酸乙酯相作為深入研究的活性萃取相。(4)通過對各萃取相化學成分預(yù)試驗,結(jié)果顯示,正丁醇相主要含有有機酸類物質(zhì),乙酸乙酯相主要為酚類物質(zhì),推測G3發(fā)酵產(chǎn)物活性物質(zhì)可能為有機酸與酚類物質(zhì)。對乙酸乙酯萃取相進行柱色譜分離獲得高活性組分Fry2-2,供試濃度為1 mg/mL時,對蘋果腐爛病原菌抑制率達到89.36%;GC-MS分析共檢測到15種化合物,主要為胺類、脂類、酚類與烷烴類。對Fry2-2進一步分離,在Fry2-2-2組分中析出化合物A,經(jīng)過重結(jié)晶純化和核磁共振等檢測,化合物A鑒定為:2,2'-亞甲基雙[6-(1,1-二甲基乙基)]-4-甲基-苯酚,抑制蘋果腐爛病原菌的IC_(50)值為0.11 mg/mL。(5)在體外和體內(nèi)條件下,對G3高活性組分抑制蘋果腐爛病的機理進行研究。結(jié)果表明:高活性組分處理下,病原菌菌絲出現(xiàn)破損、撕裂,或者頂端形成紡錘形,使其生長異常,菌絲量減少;病原菌菌液的電導率增加、麥角甾醇含量降低、幾丁質(zhì)酶活性增加;感病蘋果的體內(nèi)防御酶SOD、PPO、POD活性均明顯升高,高活性組分與5 mmol/L水楊酸兩者處理效果相近,防御酶活性都呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢,并能夠明顯抑制蘋果腐爛病斑的擴展,最大抑制率為77.61%。
【學位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：TS201.3;TS255.6
【圖文】：

云貴等地區(qū)（王偉等, 2007），除了黑龍江和南方沿海一些核桃分布（朱俊玲等, 2003; 陸俊等, 2014; 王豐俊和王建中韌，紋理美觀，適宜制造高檔用具，甚至在軍事領(lǐng)域也有）。核桃被認為是生態(tài)先鋒樹種和生物質(zhì)能源戰(zhàn)略樹種，在能力，在山丘、坡麓、梯田、堰邊栽植有涵養(yǎng)水源、保持經(jīng)濟、生態(tài)和社會效益，因此引起了社會各界的廣泛重視。植總面積已突破 200 萬公頃，年堅果總產(chǎn)量超過 50 萬噸，益。植物的化學成分研究物主要含有萘醌及其苷類、黃酮及其苷類、二芳基庚烷類類（naphthoquinones）1）、氫化胡桃醌及其苷是核桃青皮中的主要萘醌類物質(zhì)，質(zhì)，為橙色針狀結(jié)晶，具有顯著的殺蟲、抑菌和抗癌等生止血、抑菌及治療濕疹、牛皮癬等（閆克玉等, 1994）。

分別為大黃酚、大黃素甲醚、4'，8-二羥基-1-四氫萘酮。林君陽（果皮中分離得到1個萘醌類化合物，為5-羥基-2-甲氧基-1,4-萘醌。楊霞青皮中測定出胡桃醌含量為 0.84 mg/g，對馬尾松潰瘍病菌和核桃枝顯，EC50分別為 102.751 mg/L、112.808 mg/L。Li 等（2008）和從胡桃科植物中分離到 5,8-二羥基-1,4 萘醌、α-萘和 5-羥基-3,3'-雙衍生物。酮類（flavonoids）類化合物分布廣泛于植物界，多以游離態(tài)或糖苷形式存在，主要有、抗氧化、抗菌及抗病毒等活性。黃酮醇及其苷類是核桃青皮中的，姚煥英等（2003）研究表明核桃屬植物中的黃酮類化合物主要存中，主要包括櫻花亭（7-甲基二氫山奈酚）、槲皮素（6）、山奈（8）、扁蓄苷（槲皮素-3-阿拉伯糖苷）、胡桃苷（山奈酚-3-阿拉及 taxifolin。此外還有學者發(fā)現(xiàn)核桃青皮中其他黃酮類物質(zhì)，比如桑 2007）、5-羥基-3,7,3',4'-四甲氧基黃酮（10）（周媛媛等 2014）

王克建等（2009）發(fā)現(xiàn)核桃仁中包含鞣花�；咸烟� 4 種異構(gòu)體、橡 2 種異構(gòu)體、二鞣花�；咸烟� 2 種異構(gòu)體、二沒食子�；咸烟� 2 種花酰基和橡i\0�；咸烟� 3 種異構(gòu)體。王金蘭等（2008）在山核桃樹皮二甲氧基鞣花酸，山核桃酚和 4,8-二羥基萘酚-1-O-β-D-[6'-O-(3",5"-二甲甲�；�)]吡喃葡萄糖苷等。萬政敏等（2007）在普通核桃青皮中發(fā)現(xiàn)了、沒食子酸、綠原酸、阿魏、咖啡酸、對羥基苯甲酸等酚類物質(zhì)。其他成分宇彬等（2006）從核桃青皮中得到精制多糖 76.08%，粗多糖 38.07%。楸皮中還發(fā)現(xiàn)了咖啡酸、沒食子酸、逆沒食子酸、對羥基桂皮酸、琥1,2,6-三沒食子糖和 1,2,3,6-四沒食子糖。核桃楸青果皮中發(fā)現(xiàn)了對羥基草醛、咖啡酸及對羥基肉桂酸等（石建輝等, 2006; 劉元慧, 2009; 。馬良進等（2009）用不同溶劑對山核桃外果皮甲醇浸膏進行萃取分離離得到 7 個化合物：喬松酮（20），黃卡瓦胡酵素（21），5-羥基-4',（22），5-羥基-2-甲氧基-1,4-萘醌（23），5-羥基-6,7-二甲氧基黃烷酮（25）。

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本文編號：2805526