發(fā)布時間：2020-08-26 13:44

【摘要】：雌激素相關(guān)受體(ERR)作為轉(zhuǎn)錄因子家族的一員,參與調(diào)控許多重要的生命進程。在哺乳動物中,ERR與能量代謝和癌癥相關(guān),它也被作為乳腺癌和宮頸癌等相關(guān)癌癥的檢測靶標。在果蠅中,ERR可以作為能量代謝的開關(guān)來調(diào)節(jié)果蠅的發(fā)育過程。在家蠶中,目前已鑒定和克隆到了家蠶ERR基因(BmERR),并報道了BmERR可以參與調(diào)控卵黃原蛋白基因的表達。那么在家蠶中,BmERR除了參與調(diào)控卵黃原蛋白基因的表達,是否還存在其它的功能呢?本研究以家蠶胚胎發(fā)育過程這個能量代謝旺盛時期為切入點,對BmERR在家蠶胚胎發(fā)育時期的功能進行了研究,結(jié)果如下:(1)家蠶胚胎發(fā)育過程中BmERR和糖代謝相關(guān)基因的表達分析本研究首先通過RT-PCR和Western blot檢測了BmERR在家蠶胚胎時期的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平的表達特征,證實了BmERR在家蠶胚胎時期是有蛋白表達的,暗示著其可能存在著一定的生物學功能。為了研究BmERR對能量代謝的影響,本研究同時檢測了糖酵解過程中磷酸果糖激酶(BmPFK)、己糖激酶(BmHK)和丙酮酸激酶(BmPK)三個限速酶基因的表達譜。分析發(fā)現(xiàn),BmERR與上述三個糖酵解限速酶的表達趨勢很相似,預示著它們之間可能存在著一定的關(guān)聯(lián)性。(2)BmERR對糖酵解相關(guān)基因表達的影響為了驗證BmERR與BmPFK、BmHK和BmPK三個限速酶基因的關(guān)系,本研究通過過表達、干涉、抑制劑處理三種方式來改變BmERR的表達量,并分析下游糖酵解限速酶是否發(fā)生變化。首先,在BmE細胞上過表達BmERR以后,qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)糖酵解中的三個限速酶基因都顯著上調(diào);然后,通過干涉BmERR和抑制劑處理細胞,qRT-PCR檢測卻發(fā)現(xiàn)三個限速酶基因顯著下調(diào)。表明BmERR的表達量的變化會直接影響到BmHK、BmPK和BmPFK基因的表達變化。除了在細胞上干涉BmERR外,我們在蠶卵個體上也做了初步的干涉實驗。將干涉雙鏈dsBmERR和對照dsEGFP以濃度為1000 ng/μL的劑量分別注射到剛產(chǎn)下的蠶卵中,到蠶卵中的雙鏈最終濃度大約為3 ng/粒。當對照組在產(chǎn)卵后第13天時,孵化率達到67.5%;而實驗組需要在產(chǎn)卵后第14天才達到64.1%左右。表明在家蠶胚胎發(fā)育時期干涉BmERR可以延遲家蠶胚胎發(fā)育一天的時間,但不會出現(xiàn)致死。在家蠶產(chǎn)卵后第4天時,對其葡萄糖的含量進行了檢測。結(jié)果表明,注射了dsBmERR的蠶卵葡萄糖的含量有顯著性升高相比與對照組。同時,當胚胎發(fā)育到點青時提取總RNA并反轉(zhuǎn)成cDNA用于定量分析,qRT-PCR分析顯示,dsBmERR干擾會使BmHK、BmPK和BmPFK三大限速酶基因的表達顯著下調(diào)。這些結(jié)果表明,BmERR可能通過影響糖酵解途代謝徑來影響家蠶的胚胎發(fā)育。(3)BmERR影響胚胎發(fā)育的分子機制為了探究BmERR作為轉(zhuǎn)錄因子是否通過調(diào)節(jié)限速酶基因啟動子的活性來影響糖酵解限速酶的表達?本研究利用JASPAR軟件分析了BmHK、BmPK和BmPFK基因的啟動子序列并預測了ERRE元件,在它們的啟動子上都預測到了ERRE元件。本研究根據(jù)前面干涉和表達譜分析選擇了具相關(guān)性更好的基因BmPFK進行了分析。首先,構(gòu)建了一系列突變不同ERRE位點的pGL_3-BmPFKP細胞轉(zhuǎn)染載體。然后,利用雙熒光素酶報告系統(tǒng),分析了調(diào)控元件對BmPFK基因啟動子活性的影響,結(jié)果表明,ERRE-like1元件突變后,未檢測到啟動子活性變化。然而,突變ERRE-like2元件能夠顯著降低啟動子的活性。本研究進一步在家蠶胚胎細胞系BmE-SWU1細胞系中過表達BmERR,檢測了ERRE-like2元件對啟動子活性的影響,結(jié)果表明ERRE-like2對啟動子的活性有顯著上調(diào)作用。為了確定BmERR蛋白是否直接結(jié)合在BmPFK基因啟動子的ERRE-like2元件上發(fā)揮作用,本研究將生物素標記的ERRE-like2探針與重組BmERR DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(BmERR DBD)蛋白一起孵育,通過凝膠遷移實驗(EMSA)檢測,結(jié)果顯示有滯后條帶;當改變探針和蛋白的濃度時,條帶信號的強度也隨之改變;同時加入突變時,沒有出現(xiàn)滯后條帶。表明它們之間可以特異結(jié)合。同時利用ChIP實驗,也驗證BmERR可以結(jié)合在BmPFK基因啟動子的ERRE-like2元件。以上結(jié)果表明,BmERR可以結(jié)合在糖酵解限速酶基因啟動子上的ERRE元件上,直接調(diào)控糖酵解限速酶基因的表達,從而參與家蠶胚胎的發(fā)育。家蠶作為模型昆蟲,本研究的數(shù)據(jù)將進一步促進ERRs與生長發(fā)育以及能量代謝之間的理解奠定基礎(chǔ)。
【學位授予單位】：西南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：Q418
【圖文】：

圖 1.1 家蠶的生活史[1]Figure 1.1 Life history of silkworm[1]，卵有越年卵和非越年卵之分。非越年卵產(chǎn)下天便孵化而出。但是越年卵產(chǎn)下后，約一星期入一個停滯發(fā)育的“滯育期”。胚胎在滯育期間溫度下，也不會向前發(fā)育，必須在一定的條件除后才能孵化[2-4]。滯育卵的耗氧量很低，同

西南大學碩士學位論文體開始收縮，第五至第六節(jié)腹面透明，食葉減少，排出軟糞和蠶尿，體呈蠟黃半透明狀，開始吐絲，此時的蠶稱為熟蠶，熟蠶即可上蔟吐絲結(jié)繭。家蠶多數(shù)種吐絲結(jié)成的繭為白色，也有吐絲結(jié)成紅色、黃色、粉紅色、藍色等彩色繭的系。經(jīng)過 2～3 天，蠶吐完絲后便在繭內(nèi)化成蛹。家蠶在蛹期要把幼蟲的組織器加以降解、重塑最終發(fā)育為成蟲的器官。成蟲形成完成后，脫去蛹皮，羽化為蟲，破繭而出。在成蟲期，不從外界取食，具有發(fā)達的生殖器官，交配產(chǎn)卵后約經(jīng)過一星期左右自然死亡，家蠶的一個世代就此告終[6]。1.1.1 家蠶的胚胎發(fā)育過程家蠶作為鱗翅目模式昆蟲，對家蠶的胚胎發(fā)育最早進行研究的是 Tichomir(1886)，家蠶的卵呈橢圓形,長約 1.3 mm，寬約 1.05 mm，厚約 0.6 mm，1 g 卵大有 1800-2100 粒[7]。非滯育卵胚胎的發(fā)育主要經(jīng)過受精期、原核分裂期、胚盤形期、胚帶形成期、原腸化期和反轉(zhuǎn)期等。家蠶非滯育卵胚胎發(fā)育的主要過程[8]圖 1.2。

第 1 章 文獻綜述賦予同時受體二聚化和 DNA 結(jié)合所必需的蛋白質(zhì)柔韌性；含有與共用的 C 末端 AF-2 結(jié)構(gòu)域的 LBD （圖 1.3A）。ERR 作為轉(zhuǎn)錄因子，RE 元件的核心序列為“GGTCA” （圖 1.3 B），同時它可以單體的形結(jié)合，也可以形成同源二聚體，還可以與其它的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合形成式發(fā)揮作用(圖 1.3 C )[35-37]。

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前5條

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本文編號：2805250