發(fā)布時間：2020-08-26 11:13

【摘要】：不同生境中各具特性酶的挖掘,一方面要滿足不同的應(yīng)用條件對酶的催化活性、酸堿耐受性、熱穩(wěn)定性、氧化穩(wěn)定性、有機溶劑耐受性、立體異構(gòu)選擇性等的特定要求;另一方面則豐富和擴展人們對酶的各種機制的認識,以便能更好地開發(fā)甚至創(chuàng)造符合要求的酶。Anoxibacillus sp.主要分布于火山溫泉、堆肥等熱環(huán)境中,為嗜熱堿性菌,相應(yīng)地,來源于Anoxybacillus sp.的蛋白,具有耐熱和嗜堿的特性,這使Anoxybacillus sp.成為重要的微生物資源,在生物質(zhì)能源、環(huán)境污染物處理等方面發(fā)揮重要作用。本研究通過對來源于溫泉環(huán)境的Anoxibacillus sp.GXS-BL的α-淀粉酶的生化特性的分析研究,發(fā)現(xiàn)Ca2+能提高該酶的熱穩(wěn)定性,Zn2+抑制其活性,在B結(jié)構(gòu)域進行的突變改造降低其熱穩(wěn)定性和活性,由此進行的相關(guān)熱力學、動力學等方面的機理分析研究,不僅有助于對該酶的認識和利用,獲得的理論和實驗認識,還可以用于指導(dǎo)其他工業(yè)酶的開發(fā)與應(yīng)用。主要研究結(jié)果如下:采用淀粉作為單一碳源的M9培養(yǎng)基,從騰沖溫泉土壤中篩選到產(chǎn)淀粉酶的菌株Anoxybacillus sp.GXS-BL,通過序列比對和基因步移擴增,獲得該菌株的α-淀粉酶基因AGXA。將AGXA與表達載體pQE30連接,導(dǎo)入大腸桿菌M15中表達,對表達產(chǎn)物進行分離純化和酶學性質(zhì)分析。結(jié)果表明,AGXA對可溶性淀粉催化水解反應(yīng)的最適反應(yīng)pH為8.0,最適反應(yīng)溫度Topt為60 ℃,熱半失活溫度T50為63.3 ℃,熔解溫度Tm為67.3 ℃,在70℃時的半衰期t1/2小于5min,是中等耐溫堿性酶。Vmax、Km、Kcat、Kcat/tm分別為0.933×10-5 M.L-1.S-1、3.43 g.-1 2.54×102s-1、74.10 s-1g-1L;對有機溶劑和活性劑具有較強的耐受性。Na+、K+對AGXA有激活作用,Mg2+、Ca2+對該酶的活性影響不明顯,Cu2+、Co2+、Fe3+明顯抑制該酶的活性,Zn2+則完全抑制其活性。Ca2+提高AGXA的熱穩(wěn)定性。在Ca2+存在下,AGXA的最適反應(yīng)溫度Topt為70 ℃,AGXA的熱半失活溫度T50為73.8 ℃,在70 ℃時的半衰期t1/2大于200 min,熔解溫度Tm 為77.8 ℃。圓二色性分析表明,在常溫下,Ca2+的加入,并不改變AGXA的二級結(jié)構(gòu),只是使其結(jié)構(gòu)更緊湊。在升溫過程中,沒有Ca2+的AGXA在60℃以內(nèi),維持著相對穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu),隨著溫度的升高,二級結(jié)構(gòu)逐漸改變,其結(jié)構(gòu)變化主要發(fā)生在60-70℃范圍內(nèi),到70 ℃后,結(jié)構(gòu)變化結(jié)束;吸收信號值則隨溫度升高持續(xù)增大,表明蛋白在去折疊后聚集,但沒有發(fā)生沉淀。加Ca2+后,AGXA的CD譜圖發(fā)生變化的溫度范圍為70-80 ℃;吸收信號隨溫度升高先增大,然后下降,表明含Ca2+的AGXA在熱去折疊后,先聚集后沉淀。差示掃描量熱分析表明,有Ca2+的AGXA的熱容變化發(fā)生在70℃,在77.8 ℃達最大值,熱去折疊過程△H為164.7 kcal.M-1,熱容變化值△Cp為1.35 kcal.M-1℃-1;不加Ca2+時,AGXA在60 ℃時熱容升高,在67.3 ℃達最高,AH為133.0kcal.M-1,△Cp為1.83kcal.M-1℃-1。加Ca2+的AGXA通過增大熱去折疊過程中的焓變化值△H、降低熱容變化值△Cp來提高其熱穩(wěn)定性。Zn2+抑制AGXA的活性。金屬離子對酶活性影響的實驗表明,Zn2+與AGXA在40 ℃作用30 min后完全抑制其活性;圓二色性實驗表明,Zn2+與AGXA作用后,酶的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化,不再具備原有的構(gòu)型。采用量子化學方法,對組氨酸在蛋白質(zhì)中的多重作用進行能量計算的結(jié)果表明,His-Zn2+形成的配位鍵能和陽離子-π相互作用能遠遠高于氫鍵和范德華相互作用能。采用分子動力學模擬,發(fā)現(xiàn)Zn2+不僅能與AGXA中保守的His217形成配位鍵,還能與Phe178形成陽離子-π相互作用,從而使Phe178的二面角C-CA-CB-CG維持在平面角構(gòu)象,關(guān)閉AGXA的活性口袋,抑制其活性。對AGXA開展了不同溫度的分子動力學模擬,結(jié)果表明,AGXA在400 K時的構(gòu)象變化大于350 K的,氨基酸殘基偏離平衡位置明顯的主要在B結(jié)構(gòu)域。根據(jù)350 K與300 K的△RMSF值,對AGXA進行熱穩(wěn)定性改造的突變位點選取;基于能量計算,對選取位點進行虛擬飽和突變分析,選取替換氨基酸;定點突變實驗驗證;發(fā)現(xiàn)D358I提高酶的熱穩(wěn)定性,在B結(jié)構(gòu)域進行的其它突變改造降低酶的活性和熱穩(wěn)定性。
【學位授予單位】：廣西大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：Q936
【圖文】：

含有１個希臘鑰匙模體。Ｂ結(jié)構(gòu)域和Ｃ結(jié)構(gòu)域分別位于Ａ結(jié)構(gòu)域的兩側(cè)％。逡逑ｍＭ逡逑圖１－２淀粉酶的三維結(jié)構(gòu)（ＰＤＢ邋：邋１ＢＬ丨）丨８丨逡逑綠色為Ａ結(jié)構(gòu)域，洋紅色為Ｂ結(jié)構(gòu)域，藍色為Ｃ結(jié)構(gòu)域，鈣和鈉離子分別為紅色和橙色的小球，活逡逑性氨基酸Ａｓｐ２３１，Ｇｌｕ２６１和Ａｓｐ３２８用紅色表示，連接ｐ７和ｃｔ７的環(huán)用黃色表示逡逑Ｆｉｇ邋１邋－２邋Ｔｈｒｅｅ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ａ－ａｍｙｌａｓｅ邋（ＰＤＢ邋ｃｏｄｅ邋１ＢＬＩ）逡逑Ｄｏｍａｉｎ邋Ａ邋ｉｓ邋ｓｈｏｗｎ邋ｉｎ邋ｇｒｅｅｎ，邋ｄｏｍａｉｎ邋Ｂ邋ｉｓ邋ｓｈｏｗｎ邋ｉｎ邋ｍａｇｅｎｔａ邋ａｎｄ邋ｄｏｍａｉｎ邋Ｃ邋ｉｓ邋ｓｈｏｗｎ邋ｉｎ邋ｃｙａｎ．邋Ｃａｌｃｉｕｍ邋ｉｏｎｓ逡逑ａｎｄ邋ｓｏｄｉｕｍ邋ｉｏｎｓ邋ａｒｅ邋ｓｈｏｗｎ邋ａｓ邋ｒｅｄ邋ｓｐｈｅｒｅｓ邋ａｎｄ邋ｏｒａｎｇｅ邋ｓｐｈｅｒｅｓ邋ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．邋Ｔｈｅ邋ａｃｔｉｖｅ邋ｓｉｔｅ邋ｒｅｓｉｄｕｅｓ邋Ａｓｐ２３１，逡逑Ｇｌｕ２６１邋ａｎｄ邋Ａｓｐ３２８邋ａｒｅ邋ｓｈｏｗｎ邋ｉｎ邋ｒｅｄ．邋Ｔｈｅ邋ｌｏｏｐ邋ｃｏｎｎｅｃｔｉｎｇ＾邋ｔｏ邋ａ７邋ｉｓ邋ｓｈｏｗｎ邋ｉｎ邋ｙｅｌｌｏｗ逡逑ａ－淀粉酶采用對異頭碳原子構(gòu)象保留的方式切割ｃｄ—４糖苷鍵，形成具ａ構(gòu)型的產(chǎn)逡逑物，其催化機制包括三個步驟，第一步，底物淀粉鏈中的糖苷氧被質(zhì)子供體（Ｇｌｕ２６１）逡逑質(zhì)子化，－１亞位上的葡萄糖殘基的Ｃｌ被催化親核體（Ａｓｐ２３１）進行親核攻擊，糖^u鍵逡逑斷裂

４０°Ｃ邋－邋Ｉ－逡逑ｏ逡逑圖１－４嗜熱菌及其最適生長溫度ｌ１６］逡逑Ｆｉｇ邋１－４邋Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ邋ｔｒａｃｔａｂｌｅ邋ｅｘｔｒｅｍｅ邋ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ邋ａｎｄ邋ｔｈｅｉｒ邋ｏｐｔｉｍｕｍ邋ｇｒｏｗｔｈ邋ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ．逡逑Ａｎｙ邋ｏｒｇａｎｉｓｍ邋ｗｉｔｈ邋ａｎ邋ｏｐｔｉｍｕｍ邋ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ邋ａｂｏｖｅ邋４５邋°Ｃ邋ｉｓ邋ｃｌａｓｓｉｆｉｅｄ邋ａｓ邋ａ邋ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅ，邋ｂｕｔ邋ｔｈｉｓ邋ｒａｎｇｅ逡逑ｉｓｅｘｔｒｅｍｅｌｙ邋ｂｒｏａｄ邋ａｎｄ邋ｅｘｔｅｎｄｓ邋８０邋°Ｃ邋ｕｐ邋ｔｏ邋ｔｈｅ邋ｕｐｐｅｒ邋ｌｉｍｉｔ邋ｏｆ邋ｌｉｆｅ．邋Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，邋ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ邋ｈａｖｅ邋ｂｅｅｎ邋ｆｕｒｔｈｅｒ逡逑ｓｕｂｄｉｖｉｄｅｄ邋ｉｎｔｏ邋ｍｏｄｅｒａｔｅ邋ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ邋ｔｈａｔ邋ｇｒｏｗ邋ｏｐｔｉｍａｌｌｙ邋ｂｅｔｗｅｅｎ邋４５邋ａｎｄ邋７０邋°Ｃ，邋ｅｘｔｒｅｍｅｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ逡逑ｔｈａｔ邋ｇｒｏｗ邋ｏｐｔｉｍａｌｌｙ邋ａｔ邋７０邋°Ｃ邋ａｎｄ邋ａｂｏｖｅ，邋ａｎｄ邋ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ邋ｔｈａｔ邋ｇｒｏｗ邋ｏｐｔｉｍａｌｌｙ邋ａｔ邋８０邋°Ｃａｎｄ邋ａｂｏｖｅ逡逑５逡逑

幔rP槎ǚ勖傅拿稈綆災(zāi)史治黽捌淙任榷ㄐ愿腦煅芯浚]3?Ｃｐ與溫度Ｔ的曲線積分為量熱焓（Ａ／／），兩端基線的差值為ＡＣＶ４５］，如圖１－６所示。逡逑６０邋邐邐邐邐邐逡逑１５０邋—邐Ａ逡逑ＵＪ逡逑－ＩＱ邐Ａ．，，１．邋．１邋，．Ａ邋ｎｌｎ．Ａ，．，！邋？Ｉ．ｍ邋１？邋１．邋ｔｎｌ邋ｎｌ邋１邋，Ａ！邋■邋ｔ．．ｌ，．邋Ａ．Ｉ邋Ａ，邐Ｉ邋．邋Ｉ邋ｔｌ＿ＪＬ＿逡逑２０邐３０邐４０邐５０邐６０邐７０邐８０邐９０邐丨邋００逡逑Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ邋（＊Ｃ）逡逑圖１－６蛋白的雙態(tài)去折疊ＤＳＣ圖示丨４３】逡逑Ｆｉｇ邋１－６邋ＤＳＣ邋ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ邋ｆｏｒ邋ｔｈｅ邋ｔｗｏ－ｓｔａｔｅ邋ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ邋ｏｆ邋ａ邋ｇｌｏｂｕｌａｒ邋ｐｒｏｔｅｉｎ逡逑己知Ａ／／、ＡＣ’Ｐ，可由以下公式計算蛋白的吉布斯自由能ＡＧ和熵值ＡＳ。逡逑ＡＧ邋＝邋Ａ／７邋（１邋－邋Ｄ邋－邋ＡＣｐ（（ｒｍ邋－邋７０邋＋邋ｎｎ邋（Ｄ邐（１＇２）逡逑ＡＧ邋＝邋Ｇｕ邋－邋ＧＦ邋＝邋ＡＨ邋－邋ＴＡＳ邐（１－３）逡逑當ｒ＝ｒｍ時，ａｇ＝ｏ，熱焓變化ａ／／和熵變化ａｓ的作用相互補償，處于折疊和去折疊逡逑狀態(tài)的蛋白含量相等，蛋白處于這兩者的動態(tài)平衡中［４６１。逡逑ＤＳＣ是一種強大的研究蛋白熱變性的方法，不僅適用于可逆變性蛋白，也適用于不逡逑可逆熱變性蛋白｜４７］。已有大量研究采用ＤＳＣ進行蛋白熱變性過程分析，揭示蛋白的熱逡逑穩(wěn)定性機制［４８＿５（）］。逡逑（２）圓二色性（ＣＤ）逡逑圓二色性是物體對左旋和右旋圓偏振光的吸收差異Ｐ｜］。蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)可由ＣＤ逡逑光譜的遠紫外光譜區(qū)（１９０－２６０ｎｍ）確定

本文編號：2805101