【摘要】：耐輻射奇球菌(Deidoioccus ridurans,簡稱DR)是一種能忍受極端環(huán)境的微生物,對電離輻射、紫外線、干燥等環(huán)境壓力有極強的抗性。作為研究極端環(huán)境壓力抗性的模式生物之一,研究其生存機制對認識生物面對極端環(huán)境的生命活動和自然規(guī)律有著重要的意義。本研究通過生化與分子生物學(xué)等手段研究了耐輻射奇球菌的多聚磷酸鹽(Polypphosphate,PolyP)代謝及其關(guān)鍵酶功能,在分子水平上闡明了 PolyP的降解機制,還研究了鐵離子轉(zhuǎn)運相關(guān)的蛋白DR1440,探究了它們在DR菌應(yīng)對氧化脅迫壓力中的重要作用。首先,我們通過生物信息學(xué)、DAPI染色法、Urea PAGE等生化實驗方法預(yù)測并鑒定了 DR基因組內(nèi)編碼PolyP合成酶polyphosphate kinase(DrPPK)和降解酶exopolyphosphatase(DrPPX)的基因。通過菌株生長表型分析發(fā)現(xiàn),PolyP合成缺失會影響其生長;在氧化壓力H2O2脅迫下,drppk和drppx的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平均上調(diào),并且drppx相對于drppk的上調(diào)更為明顯;與野生型比較,drppk的缺失則導(dǎo)致胞內(nèi)基本無PolyP積累,同時對H2O2杭性更強;而dpppx突變株則在氧化壓力刺激后產(chǎn)生PolyP水平增加,對H202更為敏感。通過ICP-MS檢測發(fā)現(xiàn)增加的PolyP螯合了更多的胞內(nèi)Mn2+,可能引起胞內(nèi)具有抗氧化活性的Mn2+含量減少,從而導(dǎo)致菌體氧化抗性下降。結(jié)果表明,drppx及其反應(yīng)產(chǎn)物可能參與了 DR菌的氧化壓力抗性等。其次,通過解析耐輻射奇球菌DrPPX的結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn),不同于大腸桿菌EcPPX的緊密結(jié)構(gòu),DrPPX是一種新型的二聚體形式PPX,其結(jié)構(gòu)相對較為松散并且活性中心更為開放;在Mn2+存在下形成二聚體從而激活其PolyP外切酶活性,其產(chǎn)物可能以Mn2+和Pi的復(fù)合物形式參與耐輻射奇球菌的氧化抗性,且E114是DrPPX的關(guān)鍵催化活性位點。另外,我們首次解析了 DrPPX-PolyP的復(fù)合物結(jié)構(gòu)。N端的活性中心的H14、K35、R37、R271等帶正電荷的氨基酸和T10、S12、T82、S141、S212等含羥基的氨基酸參與了底物PolyP的結(jié)合;C端結(jié)構(gòu)域則為DrPPX二聚化所必需,其缺失會導(dǎo)致酶活下降;C末端的4個氨基酸參與了 Mn2+的結(jié)合,分別是H340、H377、E378、D453,其中D453位點起決定性結(jié)合作用,突變后形成不可二聚化的單體蛋白,且酶活下降。通過對C端截短的DrPPX蛋白結(jié)構(gòu)分析可知,C端可能是通過結(jié)合Mn2+形成空間作用力于N端,從而促進加強PolyP的降解作用。通過DrPPX蛋白C端截短突變和E114點突變補償株的氧化抗性表型分析,進一步驗證了 DrPPX對于耐輻射奇球菌氧化抗性具有重要意義。DrPPX和DrPPK通過控制polyP的合成與降解調(diào)控胞內(nèi)游離Mn2+的濃度參與氧化脅迫響應(yīng),而胞內(nèi)錳鐵含量比(Mn/Fe)的高低是影響耐輻射奇球菌抗氧化能力的重要因素。因此,除了 Mn2+平衡外,胞內(nèi)Fe2+代謝對于DR的氧化抗性也至關(guān)重要。本研究鑒定了耐輻射奇球菌中的一個潛在的鐵外排通道蛋白DR1440。通過序列分析表明,DR1440是一個隸屬于P-typeATPase家族中的一個PIB-typeATPases,可能參與轉(zhuǎn)運重金屬離子。通過構(gòu)建dr1440缺失突變株,發(fā)現(xiàn)突變株胞內(nèi)鐵離子的水平提高,并且對亞鐵離子更為敏感;同時對過氧化氫(H2O2)、γ射線輻照等氧化壓力也更為敏感。在H202的壓力下,突變株胞內(nèi)產(chǎn)生了更多的ROS并導(dǎo)致更嚴重的蛋白羰基化,表明氧化壓力下耐輻射奇球菌DR1440可能通過鐵離子的外排作用,防御細胞內(nèi)由于亞鐵離子介導(dǎo)的Fenton反應(yīng)形成ROS對蛋白、核酸等生物大分子的氧化損傷。最后,我們通過點突變發(fā)現(xiàn)了 DR1440的SPC motif中的S297和C299兩個位點的突變會導(dǎo)致胞內(nèi)鐵的積累同時對H202壓力表現(xiàn)得更為敏感,表明S297和C299可能是DR1440的重要功能位點。本研究鑒定了耐輻射奇球菌中PolyP代謝關(guān)鍵酶及其功能,首次發(fā)現(xiàn)外切酶DrPPX特殊的二聚體調(diào)控機制及其酶催化的分子機制,揭示了 PolyP代謝與氧化壓力脅迫的關(guān)系。另外,研究發(fā)現(xiàn)了鐵離子轉(zhuǎn)運相關(guān)蛋白DR1440,探討了其在菌體應(yīng)對氧化壓力脅迫中的作用。研究結(jié)果一方面拓寬了對參與多聚磷酸鹽代謝的外切酶的催化和調(diào)控機制的認識,另外加深了對多聚磷酸鹽、Mn、Fe參與氧化壓力脅迫抗性的全局認識,為揭示耐輻射奇球菌極端環(huán)境抗性機理提供新的思路。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：Q936

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本文編號：2800248